अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो और विवो में के लिए decellularized सेब व्युत्पन्न मचान
Summary
इस अध्ययन में, हम decellularization, शारीरिक लक्षण वर्णन, इमेजिंग, और संयंत्र आधारित biomaterials के vivo आरोपण के तरीकों, साथ ही सेल बोने और मचान में भेदभाव के लिए तरीकों का विस्तार. वर्णित विधियां हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पौधे आधारित बायोमैटेरियल्स के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं।
Abstract
प्लांट-व्युत्पन्न सेलूलोज़ बायोमैटेरियल्स को विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में नियोजित किया गया है। विवो अध्ययनों में प्राकृतिक स्रोतों से प्राप्त सेलूलोज़ से बने मचानों की उल्लेखनीय जैव-अनुकूलता दिखाई गई है। इसके अतिरिक्त, इन मचानों में संरचनात्मक विशेषताएं होती हैं जो कई ऊतकों के लिए प्रासंगिक होती हैं, और वे स्तनधारी कोशिकाओं के आक्रमण और प्रसार को बढ़ावा देती हैं। डिसेलुलराइज्ड सेब हाइपेंथियम ऊतक का उपयोग करते हुए हाल के शोध ने इसके छिद्र आकार की समानता को ट्रैब्युलर हड्डी के साथ-साथ ओस्टोजेनिक भेदभाव का प्रभावी ढंग से समर्थन करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। वर्तमान अध्ययन ने हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग (बीटीई) अनुप्रयोगों के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की क्षमता की जांच की और इन विट्रो और विवो मैकेनिकल गुणों में उनका मूल्यांकन किया। MC3T3-E1 प्रीओस्टियोब्लास्ट्स को सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में वरीयता दी गई थी जिन्हें तब उनकी ओस्टोजेनिक क्षमता और यांत्रिक गुणों के लिए मूल्यांकन किया गया था। क्षारीय फॉस्फेट और एलिज़रीन लाल एस धुंधला भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत मचानों में ओस्टोजेनिक भेदभाव की पुष्टि की। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा ने मचानों में व्यापक सेल आक्रमण और खनिजकरण का प्रदर्शन किया। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) ने मचानों की सतह पर खनिज समुच्चय का खुलासा किया, और ऊर्जा-फैलाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) ने फॉस्फेट और कैल्शियम तत्वों की उपस्थिति की पुष्टि की। हालांकि, सेल भेदभाव के बाद यंग के मापांक में उल्लेखनीय वृद्धि के बावजूद, यह स्वस्थ हड्डी के ऊतकों की तुलना में कम रहा। विवो अध्ययनों में सेल घुसपैठ और चूहे calvaria में आरोपण के 8 सप्ताह के बाद decellularized सेब व्युत्पन्न मचान के भीतर बाह्य मैट्रिक्स के जमाव से पता चला. इसके अलावा, हड्डी दोष से मचानों को हटाने के लिए आवश्यक बल देशी कैल्वरियल हड्डी के पहले रिपोर्ट किए गए फ्रैक्चर लोड के समान था। कुल मिलाकर, यह अध्ययन पुष्टि करता है कि सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ बीटीई अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार है। हालांकि, इसके यांत्रिक गुणों और स्वस्थ हड्डी के ऊतकों के बीच असमानता इसके आवेदन को कम लोड-असर परिदृश्यों तक सीमित कर सकती है। लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों के यांत्रिक गुणों को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त संरचनात्मक पुन: इंजीनियरिंग और अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
Introduction
चोट या बीमारी के कारण होने वाले बड़े हड्डी दोषों को अक्सर पूर्ण पुनर्जनन के लिए बायोमटेरियल ग्राफ्ट की आवश्यकता होती है1. हड्डी के ऊतकों के उत्थान में सुधार के लिए डिज़ाइन की गई वर्तमान तकनीकें नियमित रूप से ऑटोलॉगस, एलोजेनिक, ज़ेनोजेनिक या सिंथेटिक ग्राफ्ट का उपयोग करती हैं2. ऑटोलॉगस बोन ग्राफ्टिंग के लिए, बड़े हड्डी दोषों को ठीक करने के लिए “गोल्ड स्टैंडर्ड” ग्राफ्टिंग अभ्यास माना जाता है, रोगी से हड्डी निकाली जाती है। हालांकि, इस ग्राफ्टिंग प्रक्रिया में आकार और आकार की सीमाओं, ऊतक उपलब्धता और नमूना साइट रुग्णता3 सहित कई कमियां हैं। इसके अलावा, ऑटोलॉगस ग्राफ्टिंग प्रक्रियाएं सर्जिकल साइट संक्रमण, बाद में फ्रैक्चर, नमूना या पुनर्निर्माण स्थल पर हेमेटोमा गठन, और पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द4 के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग (बीटीई) पारंपरिक हड्डी ग्राफ्टिंग विधियों के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करता है5. यह नए कार्यात्मक हड्डी ऊतक के निर्माण के लिए संरचनात्मक बायोमैटिरियल्स और कोशिकाओं को जोड़ती है। बीटीई के लिए बायोमैटिरियल्स डिजाइन करते समय, एक मैक्रोपोरस संरचना, सतह रसायन विज्ञान को संयोजित करना महत्वपूर्ण है जो सेल लगाव को बढ़ावा देता है, और यांत्रिक गुण जो देशी हड्डी6 के समान होते हैं। पिछले शोध ने संकेत दिया है कि बीटीई में उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स के लिए आदर्श ताकना आकार और लोचदार मापांक क्रमशः ग्राफ्टिंग साइट8 के आधार पर लगभग 100-200 माइक्रोन7 और 0.1-20 जीपीए हैं। इसके अलावा, मचानों की सरंध्रता और ताकना इंटरकनेक्टिविटी सेल माइग्रेशन, पोषक तत्व प्रसार और एंजियोजेनेसिस8 को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं।
बीटीई ने हड्डी ग्राफ्ट के वैकल्पिक विकल्पों के रूप में विकसित और मूल्यांकन किए गए विभिन्न बायोमैटिरियल्स के साथ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। इनमें से कुछ बायोमैटेरियल्स ऑस्टियोइंडक्टिव सामग्री, हाइब्रिड सामग्री और उन्नत हाइड्रोजेलहैं 8. ऑस्टियोइंडक्टिव सामग्री नवगठित हड्डी संरचनाओं के विकास को उत्तेजित करती है। हाइब्रिड सामग्री सिंथेटिक और/या प्राकृतिक पॉलिमर से बनी होती है8. उन्नत हाइड्रोगेल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की नकल करते हैं और हड्डी के ऊतकोंके एकीकरण को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक बायोएक्टिव कारकों को वितरित करने में सक्षम हैं। हाइड्रोक्सीपाटाइट एक पारंपरिक सामग्री है और इसकी संरचना और जैव-अनुकूलता9 के कारण बीटीई के लिए एक आम विकल्प है। बायोएक्टिव ग्लास बीटीई के लिए बायोमेट्रिक का एक अन्य प्रकार है, जिसे ऑस्टियोजेनेसिस10,11के लिए आवश्यक जीन को सक्रिय करने के लिए विशिष्ट सेल प्रतिक्रियाओं को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है। पॉली (ग्लाइकोलिक एसिड) और पॉली (लैक्टिक एसिड) सहित बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, बीटीई अनुप्रयोगों में भी बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है12. अंत में, प्राकृतिक या स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न पॉलिमर जैसे चिटोसन, चिटिन और बैक्टीरियल सेलूलोज़ ने भी बीटीई13 के लिए उत्साहजनक परिणामों का प्रदर्शन किया है। हालांकि, जबकि सिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर दोनों बीटीई के लिए क्षमता दिखाते हैं, वांछित मैक्रोस्ट्रक्चर के साथ एक कार्यात्मक मचान के विकास के लिए आमतौर पर व्यापक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
इसके विपरीत, देशी मैक्रोस्कोपिक सेलूलोज़ संरचनाओं को विभिन्न पौधों से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और हमारे शोध समूह ने पहले पौधों से विभिन्न ऊतक पुनर्निर्माण के लिए प्राप्त सेलूलोज़-आधारित मचानों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया था। दरअसल, एक साधारण सर्फेक्टेंट उपचार के बाद, हमने पौधे की सामग्री की अंतर्निहित संरचना का उपयोग किया, एक बहुमुखी बायोमटेरियल14 के रूप में इसकी क्षमता को उजागर किया। इसके अलावा, इन सेलूलोज़ आधारित मचानों इन विट्रो स्तनधारी सेल संस्कृति अनुप्रयोगों14 में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, biocomcompatible हैं, और समर्थन सहज चमड़े के नीचे संवहनी 14,15,16,17. हमारे शोध समूह और अन्य दोनों ने प्रदर्शित किया है कि इन मचानों को इच्छित अनुप्रयोग 14,15,16,17,18,19,20 के आधार पर विशिष्ट पौधों से प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पौधे के तनों और पत्तियों में मनाया संवहनी संरचना पशु ऊतकों19 में पाया संरचना के लिए एक हड़ताली समानता प्रदर्शित करता है. इसके अतिरिक्त, पौधों से व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों को आसानी से आकार दिया जा सकता है और वांछित विशेषताओं16 को प्राप्त करने के लिए सतह जैव रासायनिक संशोधनों के अधीन किया जा सकता है। हाल के एक अध्ययन में, हम decellularization प्रक्रिया के दौरान एक नमक बफर शामिल, बढ़ाया सेल लगाव दोनों इन विट्रो में और विवो सेटिंग्स16 में मनाया. एक ही अध्ययन में, हमने मचानों की सतह पर हाइड्रोगेल कास्टिंग करके समग्र बायोमैटेरियल्स में पौधे-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया। हाल के अध्ययनों में, संयंत्र व्युत्पन्न मचानों के functionalization उनकी प्रभावशीलता18 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, फोंटाना एट अल (2017) द्वारा किए गए एक अध्ययन से पता चला है कि मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के आसंजन को आरजीडी-लेपित विकोशियीकृत उपजी द्वारा समर्थित किया गया था, जबकि गैर-लेपित उपजी समान क्षमता18 का प्रदर्शन नहीं करते थे। इसके अलावा, लेखकों ने यह भी प्रदर्शित किया कि संशोधित नकली शरीर के तरल पदार्थ का उपयोग कृत्रिम रूप से विकोशियीकृत पौधे के तनों को खनिज बनाने के लिए किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों में, हमने पौधे से व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में मेकेनोसेंसिटिव ओस्टोजेनेसिस की अवधारणा का पता लगाया और बीटीई17,20 के लिए उनकी क्षमता का आकलन किया। इसके अलावा, ली एट अल (2019) ने इन विट्रो सेटिंग21 में हड्डी जैसे ऊतकों की खेती करने के लिए पौधे-व्युत्पन्न मचानों का उपयोग किया। विभिन्न पौधों के स्रोतों के व्यापक मूल्यांकन के माध्यम से, लेखकों ने सेब-व्युत्पन्न मचानों को मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) की संस्कृति और भेदभाव के लिए सबसे इष्टतम के रूप में पहचाना। इसके अलावा, लेखकों ने प्रस्तावित किया कि सेब-व्युत्पन्न मचानों की संरचनात्मक और यांत्रिक विशेषताएं इच्छित उद्देश्य के लिए उनकी उपयुक्तता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में लागू प्रारंभिक पौधे व्युत्पन्न मचान होने के नाते, सेब-व्युत्पन्न मचानों को बड़े पैमाने पर मानव हड्डी के समान वास्तुकला के अधिकारी के रूप में दिखाया गया है, विशेष रूप से व्यास14,21 में 100 से 200 माइक्रोन तक के उनके परस्पर जुड़े छिद्रों के संदर्भ में।
वर्तमान अध्ययन में, हमने बीटीई के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की क्षमता की जांच की और इन विट्रो और विवो दोनों में उनके यांत्रिक गुणों का विश्लेषण किया। हालांकि बीटीई 17,20,21 के लिए सेब-व्युत्पन्न मचानों की क्षमता पर अध्ययन किया गया है, लेकिन उनके यांत्रिक गुणों की जांच की गई है। परिणामों ने MC3T3-E1 प्रीओस्टियोब्लास्ट्स के वाइल्डस्प्रेड आक्रमण और ओस्टोजेनिक भेदभाव को दिखाया, जो मचानों में वरीयता प्राप्त थे जो 4 सप्ताह के लिए भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत थे। इन मचानों का यंग मापांक 192.0 ± 16.6 kPa था, जो रिक्त मचानों (बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान) (31.6 ± 4.8 kPa) और गैर-भेदभाव माध्यम (24.1 ± 8.8 kPa) में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों की तुलना में काफी अधिक था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्वस्थ मानव हड्डी ऊतक के यंग मापांक आम तौर पर त्रिकोणीय हड्डी के लिए 0.1-2 GPa और cortical हड्डी8 के लिए लगभग 15-20 GPa की सीमा के भीतर गिर जाता है. फिर भी, एक कृंतक कैल्वरियल दोष में 8 सप्ताह के आरोपण के बाद, सेल-सीडेड मचान आसपास की हड्डी में अच्छी तरह से एकीकृत दिखाई दिए, जैसा कि पुश-आउट परीक्षणों में 113.6 एन ± 18.2 एन के औसत शिखर बल द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जो देशी कैल्वरियल हड्डी22 के पहले रिपोर्ट किए गए फ्रैक्चर लोड के समान है। कुल मिलाकर, इस अध्ययन से प्राप्त परिणाम महत्वपूर्ण वादा दिखाते हैं, विशेष रूप से गैर-लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए। हालांकि, सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में वर्तमान में एक प्रत्यारोपण स्थल पर आसपास के हड्डी के ऊतकों से ठीक मेल खाने के लिए आवश्यक यांत्रिक गुण नहीं हैं। नतीजतन, इन मचानों की पूरी क्षमता को अनलॉक करने के लिए और विकास की आवश्यकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो और विवो अध्ययनों में कई ने पौधे से व्युत्पन्न सेलूलोज़ की जैव-अनुकूलता और ऊतक इंजीनियरिंग 14,15,16,18,19,20 में इसके संभावित उपयोग का प्रदर्शन किया है, विशेष रूप से ओस्टोजेनिक भेदभाव<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए वित्त पोषण कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (डिस्कवरी ग्रांट) और ली का शिंग फाउंडेशन द्वारा प्रदान किया गया था। एमएलएल को ओंटारियो सेंटर ऑफ एक्सीलेंस टैलेंटएज प्रोग्राम से समर्थन मिला, और आरजेएच को एनएसईआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति और ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप (ओजीएस) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
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