Decellulariserade strukturer från äpplen för benvävnadsteknik in vitro och in vivo

Summary

I denna studie beskriver vi metoder för decellularisering, fysikalisk karakterisering, avbildning och in vivo implantation av växtbaserade biomaterial, samt metoder för cellsådd och differentiering i ställningarna. De beskrivna metoderna gör det möjligt att utvärdera växtbaserade biomaterial för benvävnadstekniska tillämpningar.

Abstract

Biomaterial av växtbaserad cellulosa har använts i olika vävnadstekniska tillämpningar. In vivo-studier har visat den anmärkningsvärda biokompatibiliteten hos byggnadsställningar gjorda av cellulosa som härrör från naturliga källor. Dessutom har dessa strukturer strukturella egenskaper som är relevanta för flera vävnader, och de främjar invasion och proliferation av däggdjursceller. Ny forskning med hjälp av decellulariserad äppelhypanthiumvävnad har visat likheten i dess porstorlek med trabekulärt ben samt dess förmåga att effektivt stödja osteogen differentiering. I den aktuella studien undersöktes vidare potentialen hos cellulosaställningar från äpplen för tillämpningar inom benvävnadsteknik (BTE) och deras mekaniska egenskaper in vitro och in vivo . MC3T3-E1 preosteoblaster såddes i äppelbaserade cellulosaställningar som sedan bedömdes för sin osteogena potential och mekaniska egenskaper. Alkaliskt fosfatas och alizarinrött S-färgning bekräftade osteogen differentiering i byggnadsställningar odlade i differentieringsmedium. Histologisk undersökning visade på utbredd cellinvasion och mineralisering över ställningarna. Svepelektronmikroskopi (SEM) avslöjade mineralaggregat på ytan av byggnadsställningarna, och energidispersiv spektroskopi (EDS) bekräftade förekomsten av fosfat- och kalciumelement. Men trots en signifikant ökning av Youngs modul efter celldifferentiering, förblev den lägre än för frisk benvävnad. In vivo-studier visade cellinfiltration och deponering av extracellulär matris i de decellulariserade äppelbaserade stöden efter 8 veckors implantation i råtta calvaria. Dessutom var den kraft som krävdes för att ta bort ställningarna från bendefekten liknande den tidigare rapporterade frakturbelastningen av naturligt kalvarben. Sammantaget bekräftar denna studie att cellulosa från äpplen är en lovande kandidat för BTE-ansökningar. Olikheten mellan dess mekaniska egenskaper och de hos frisk benvävnad kan dock begränsa dess tillämpning till scenarier med låg belastning. Ytterligare strukturell omkonstruktion och optimering kan vara nödvändig för att förbättra de mekaniska egenskaperna hos cellulosaställningar från äpplen för bärande applikationer.

Introduction

Stora bendefekter orsakade av en skada eller sjukdom kräver ofta biomaterialtransplantat för fullständig regenerering¹. Nuvarande tekniker som är utformade för att förbättra regenerering av benvävnad använder regelbundet autologa, allogena, xenogena eller syntetiska transplantat². För autolog bentransplantation, som anses vara “guldstandarden” för transplantation för att reparera stora bendefekter, extraheras ben från patienten. Denna ympningsprocedur har dock flera nackdelar, inklusive storleks- och formbegränsningar, vävnadstillgänglighet och morbiditet på provtagningsstället³. Dessutom är autologa transplantationsprocedurer känsliga för infektioner i operationsområdet, efterföljande frakturer, hematombildning vid provtagnings- eller rekonstruktionsstället och postoperativ smärta⁴. Benvävnadsteknik (BTE) erbjuder ett potentiellt alternativ till konventionella bentransplantationsmetoder⁵. Den kombinerar strukturella biomaterial och celler för att bygga ny funktionell benvävnad. Vid design av biomaterial för BTE är det viktigt att kombinera en makroporös struktur, ytkemi som främjar cellbindning och mekaniska egenskaper som liknar dem hos naturligt ben⁶. Tidigare forskning har indikerat att den ideala porstorleken och elasticitetsmodulen för biomaterial som används i BTE är cirka 100-200 μm⁷ respektive 0,1-20 GPa, beroende på ympningsställe⁸. Dessutom är porositeten och porsammankopplingen av ställningarna kritiska faktorer som påverkar cellmigration, näringsdiffusion och angiogenes⁸.

BTE har visat lovande resultat med olika biomaterial som utvecklats och utvärderats som alternativ till bentransplantat. Några av dessa biomaterial är osteoinduktiva material, hybridmaterial och avancerade hydrogeler⁸. Osteoinduktiva material stimulerar utvecklingen av nybildade benstrukturer. Hybridmaterial består av syntetiska och/eller naturliga polymerer⁸. Avancerade hydrogeler efterliknar den extracellulära matrisen (ECM) och kan leverera de nödvändiga bioaktiva faktorerna för att främja benvävnadsintegration⁸. Hydroxiapatit är ett traditionellt material och ett vanligt val för BTE på grund av dess sammansättning och biokompatibilitet⁹. Bioaktivt glas är en annan typ av biomaterial för BTE, som har visat sig stimulera specifika cellsvar för att aktivera gener som är nödvändiga för osteogenes^10,11. Biologiskt nedbrytbara polymerer, inklusive poly(glykolsyra) och poly(mjölksyra), har också använts i stor utsträckning i BTE-tillämpningar¹². Slutligen har naturliga eller naturligt framställda polymerer som kitosan, kitin och bakteriell cellulosa också visat uppmuntrande resultat för BTE¹³. Men även om både syntetiska och naturliga polymerer visar potential för BTE, kräver utvecklingen av en funktionell ställning med den önskade makrostrukturen vanligtvis omfattande protokoll.

Omvänt kan inhemska makroskopiska cellulosastrukturer lätt härledas från olika växter och vår forskargrupp har tidigare visat att cellulosabaserade strukturer som härrör från växter kan användas för olika vävnadsrekonstruktioner. Efter en enkel ytaktiv behandling utnyttjade vi växtmaterialets inneboende struktur och lyfte fram dess potential som ett mångsidigt biomaterial¹⁴. Dessutom kan dessa cellulosabaserade strukturer användas för in vitro-cellodling av däggdjur¹⁴, är biokompatibla och stöder spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vår forskargrupp och andra har visat att dessa ställningar kan erhållas från specifika växter baserat på den avsedda applikationen 14,15,16,17,18,19,20. Till exempel uppvisar den kärlstruktur som observerats i växtstammar och blad en slående likhet med den struktur som finns i djurvävnader¹⁹. Dessutom kan cellulosaställningar som härrör från växter lätt formas och utsättas för ytbiokemiska modifieringar för att uppnå de önskade egenskaperna¹⁶. I en nyligen genomförd studie införlivade vi en saltbuffert under decellulariseringsprocessen, vilket ledde till ökad cellbindning som observerades både i in vitro– och in vivo-miljöer ¹⁶. I samma studie demonstrerade vi tillämpbarheten av växtbaserade cellulosaställningar i kompositbiomaterial genom att gjuta hydrogeler på ytan av ställningarna. I nyligen genomförda studier har funktionaliseringen av växtbaserade ställningar visat sig förbättra deras effektivitet¹⁸. Till exempel visade en studie utförd av Fontana et al. (2017) att vidhäftningen av humana dermala fibroblaster stöddes av RGD-belagda decellulariserade stjälkar, medan icke-belagda stjälkar inte uppvisade samma förmåga¹⁸. Dessutom visade författarna också att modifierad simulerad kroppsvätska kunde användas för att artificiellt mineralisera decellulariserade växtstammar. I nyare studier har vi undersökt begreppet mekanokänslig osteogenes i växtbaserade cellulosastrukturer och bedömt deras potential för BTE^17,20. Dessutom använde Lee et al. (2019) växtbaserade byggnadsställningar för att odla benliknande vävnader i en in vitro-miljö ²¹. Genom omfattande utvärderingar av olika växtkällor identifierade författarna äppelbaserade strukturer som de mest optimala för odling och differentiering av humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC). Vidare föreslog författarna att de strukturella och mekaniska egenskaperna hos de äppelbaserade ställningarna spelar en avgörande roll för deras lämplighet för det avsedda ändamålet. Som de första växtbaserade stödstrukturer som implementerades i vävnadstekniska tillämpningar, har det i stor utsträckning visat sig att de har en slående lik arkitektur som mänskligt ben, särskilt när det gäller deras sammankopplade porer som sträcker sig från 100 till 200 μm i diameter^14,21.

I den aktuella studien undersökte vi vidare potentialen hos äppelbaserade cellulosaställningar för BTE och genomförde en analys av deras mekaniska egenskaper både in vitro och in vivo. Även om det har gjorts studier om potentialen hos ställningar som härrör från äpplen för BTE 17,20,21, har deras mekaniska egenskaper undersökts för lite. Resultaten visade vildspridd invasion och osteogen differentiering av MC3T3-E1 preosteoblaster sådda i scaffolds som odlades i differentieringsmedium i 4 veckor. Youngs modul för dessa ställningar var 192,0 ± 16,6 kPa, vilket var signifikant högre än för de tomma ställningarna (ställningar utan fröceller) (31,6 ± 4,8 kPa) och de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det bör dock noteras att Youngs modul av frisk mänsklig benvävnad vanligtvis faller inom intervallet 0,1-2 GPa för trabekulärt ben och cirka 15-20 GPa för kortikalt ben⁸. Icke desto mindre, efter en 8-veckors implantation i en gnagare, verkade de cellsådda ställningarna vara väl integrerade i det omgivande benet, vilket demonstrerades av en genomsnittlig toppkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tester, vilket liknar den tidigare rapporterade frakturbelastningen av naturligt kalvarben²². Sammantaget visar resultaten från denna studie betydande löften, särskilt för icke-bärande applikationer. Cellulosaställningar från äpplen har dock för närvarande inte de mekaniska egenskaper som krävs för att exakt matcha den omgivande benvävnaden på ett implantatställe. Följaktligen krävs ytterligare utveckling för att frigöra den fulla potentialen hos dessa ställningar.

Protocol

De experimentella protokollen granskades och godkändes av University of Ottawa Animal Care Committee. 1. Förberedelse av ställning Använd en mandolinskärare för att skära McIntosh-äpplen (Canada Fancy) i 8 mm tjocka skivor. Skär hypanthiumvävnaden i äppelskivorna i rutor på 5 mm x 5 mm. Placera de fyrkantiga proverna i 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 2 dagar. Tvätta de decellulariserade proverna med avjoniserat vatten och inkubera d…

Representative Results

Mätning av porstorlek, cellfördelning och in vitro-mineralisering (Figur 1 och Figur 2)Fullständigt avlägsnande av de naturliga cellulära komponenterna i äppelvävnadsställningarna uppnåddes efter behandling av stödstrukturerna med SDS och CaCl2 (figur 1A). Ställningarna uppvisade en mycket porös struktur, vilket bekräftades med hjälp av konfokalmikroskopi. Kvantifieringen av bil…

Discussion

Flera in vitro– och in vivo-studier har visat biokompatibiliteten hos växtbaserad cellulosa och dess potentiella användning inom vävnadsteknik 14,15,16,18,19,20, mer specifikt för att hysa osteogen differentiering ^20,21. Syftet med denna studie v…

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology