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암 연구학

从新鲜组织中建立胰腺癌来源的肿瘤类器官和成纤维细胞

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65229
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1Molecular Epidemiology and Predictive Tumor Markers Group, Area 3,Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 2The Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC), 3Biobank and Biomodels Platform (PT20/0045), ISCIII research and development platforms in biomedicine and health sciences, BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, Spanish National Biobanks Network (ISCIII Biobank Register No. B.0000678),Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 4Faculty of Medicine,University of Alcalá de Henares, 5Institute of Tissue Medicine and Pathology,University of Bern, 6Department of Molecular Oncology, Cancer Research Institute,Biomedical Research Center of the Slovak Academy of Sciences, 7Experimental Oncology, Molecular Oncology Program,Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), 8Department of Surgical Oncology, National Cancer Institute,Slovak Medical University, 9Pancreatic and Biliopancreatic Surgery Unit,Hospital Universitario Ramón y Cajal, 10Department of Pathology,Hospital Universitario Ramón y Cajal, 11Department of Radiation Oncology,Hospital Universitario Ramón y Cajal, 12Department of Cancer,Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (IIBM), 13Cancer Stem Cell and Fibroinflammatory Group, Chronic Diseases and Cancer, Area 3,IRYCIS

Summary

肿瘤类器官彻底改变了癌症研究和个性化医疗方法。它们代表了一种临床相关的肿瘤模型，使研究人员能够在临床上领先于肿瘤。该方案从新鲜的胰腺肿瘤组织样本和胰腺癌来源的患者来源的异种移植物中建立肿瘤类器官。

Abstract

肿瘤类器官是三维 （3D） 离体 肿瘤模型，可概括原始原发肿瘤组织的生物学关键特征。患者来源的肿瘤类器官已用于转化癌症研究，可用于评估治疗敏感性和耐药性、细胞间相互作用以及肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用。肿瘤类器官是复杂的培养系统，需要先进的细胞培养技术和具有特定生长因子混合物和模拟细胞外环境的生物基底膜的培养基。建立原发性肿瘤培养的能力很大程度上取决于肿瘤的起源组织、细胞性和临床特征，例如肿瘤分级。此外，组织样本采集、材料质量和数量以及正确的生物样本库和储存是该程序的关键要素。实验室的技术能力也是需要考虑的关键因素。在这里，我们报告了一种经过验证的 SOP/方案，该方案在技术和经济上是可行的，可用于从胰腺癌来源的新鲜组织样本中培养离体肿瘤类器官，无论是来自新鲜的原发性切除的患者供 体 组织或患者来源的异种移植物 （PDX）。本文描述的技术可以在具有基本组织培养和小鼠设施的实验室中进行，并且是为转化肿瘤学领域的广泛应用而量身定制的。

Introduction

肿瘤类器官是体外三维 （3D） 组织培养物，来源于新鲜肿瘤组织并提供癌症模型。肿瘤类器官概括了原始原发肿瘤1、2、3、4 的生物学关键特征，可以扩增长达数月并冷冻保存，类似于传统的永生化细胞系。肿瘤类器官为转化/个性化医学提供了患者来源的肿瘤模型的生物库5，代表了癌细胞生物学系统/模型的重要进展。患者来源的肿瘤类器官可用作离体模型，以预测（新）辅助肿瘤/药物治疗的疗效，从新鲜肿瘤组织建立培养物，并在患者特异性的基础上进行药物敏感性测定或药物分型，以确定后续治疗线的有效药物1,4.此外，肿瘤类器官克服了原发肿瘤组织可用性的限制，更重要的是，它为体内小鼠模型（如患者来源的异种移植物 （PDX）2））提供了极好的替代或补充系统。如果原发性肿瘤细胞与肿瘤微环境 （TME） 中发现的基质细胞（例如癌症相关成纤维细胞 （CAF）、内皮细胞和免疫细胞）结合，则肿瘤类器官的复杂性会增加，这些细胞模仿原发肿瘤的功能和复杂细胞性。已使用标准化方案6、7、8、9、10 为许多肿瘤类型建立了肿瘤类器官。类器官从不同的实体瘤（包括结直肠癌和乳腺癌组织）传播是公认的，并且在技术上是负担得起的11,12,13,14,15。

手术肿瘤切除术或肿瘤活检可提供原发性肿瘤组织标本。理想情况下，肿瘤组织标本应来自肿瘤肿块的中心或肿瘤的侵袭边缘，以及与肿瘤相邻的正常组织。与传统的 2D 培养相比，肿瘤类器官需要几个“附加组件”，包括模拟细胞外 TME 的生物基底膜（如基质凝胶、水凝胶或基于胶原的支架），以及提供特定营养物质和生长因子并支持培养物中细胞增殖和活力的液体生长培养基16。

原代细胞培养中最基本的步骤是在盐水溶液中洗涤组织以防止污染，机械地将肿瘤切割/消化成 1-3 mm3 的小块，并用胶原酶处理以酶消化组织。然后过滤消化的混合物以除去大的组织碎片，重悬于生物基底膜（如基质胶）中，并在低附着培养板中作为圆顶接种以增强非附着生长。基底膜基质圆顶覆盖有液体培养基，并补充谷氨酰胺和抗生素以避免污染，以及取决于组织类型的特定生长因子7,8,9,16,17。也可以分离出存在于块状肿瘤和 TME 中的其他相关细胞，例如癌症相关成纤维细胞 （CAF） 和免疫细胞。该技术最近已被审查18，允许建立与不同细胞类型的共培养物，以研究在更“现实”的肿瘤环境中对治疗的反应。此外，可以研究细胞间相互作用以及肿瘤细胞与周围生物基质成分之间的相互作用。

据报道，使用活检新鲜组织或切除的胃肠道肿瘤组织建立肿瘤类器官的成功率约为 50%11，后者的成功率很大程度上取决于组织类型和来源4，特别是肿瘤分级和整体肿瘤细胞性。三维肿瘤模型具有不同的复杂性，从简单的单细胞聚集体到由各种细胞类型组成的高度复杂的工程模型。文献中用于描述 3D 培养物的术语高度不一致 19,20,21，因为使用了不同的术语，例如球状体、肿瘤球和类器官，尽管它们之间的区别尚不清楚。由于尚未就定义达成明确的共识，在本文中，肿瘤类器官被描述为嵌入生物基底膜中的有组织的肿瘤细胞培养物。

在此，报道了一种经过验证的方案，用于从源自新鲜原发性切除或PDX衍生的胰腺导管腺癌（PDAC）的新鲜组织样本中建立肿瘤类器官，并且该协议可以在大多数具有基本组织培养设施的实验室中进行。该协议改编自目前用于从David Tuveson9，Hans Clevers8和Aurel Perren7组的消化肿瘤组织建立肿瘤类器官或肿瘤样的几种最新报道的方案。

该协议不讨论如何收获新鲜组织。为了获得高质量的新鲜人类肿瘤组织，在收获组织的外科医生和提取组织样本进行类器官培养的病理科之间进行有效协调非常重要。同样，当使用 PDX 作为新鲜组织源时，与采集组织样本的人进行有效协调也很重要。为了保持高质量，尽快获得组织样本（在收获后 30-60 分钟内）至关重要。

Protocol

所有程序均按照马德里自治大学伦理委员会（CEI 103-1958-A337）和马德里自治大学（PROEX 294/19）批准的实验动物福利机构指南进行，并符合《涉及动物的生物医学研究的国际指导原则》中规定的动物护理和使用道德行为准则， 由国际医学科学组织理事会（CIOMS）开发。该协议遵循具有书面知情同意书的生物医学研究的伦理原则。使用新鲜组织建立肿瘤类器官培养物已获得事先伦理批准。样本由 Ramón …

Representative Results

重要的是要记录肿瘤类器官培养物如何随时间推移，特别是在最初的几周内，以便估计培养物在下游检测中的表现。图 2 显示了在 15 天内从新鲜组织中分离最佳肿瘤细胞和建立肿瘤类器官的示例。有时，样本中有大量的细胞碎片，很难看到正在发育的肿瘤类器官，如图3所示。此外，发育中的类器官的表型可以从分离的圆形类器官（图4A…

Discussion

药物癌症治疗的重大进展具有挑战性，因为药物在I期肿瘤临床试验中获得批准的可能性为5.1%，是所有疾病类型中最低的23。主要原因是癌症的异质性很强，因此，患者队列对给定治疗的反应并不一致，这凸显了需要一种更加个性化的方法。二维 （2D） 培养物已用于转化癌症研究多年，但缺乏原发性肿瘤中发现的结构性 3D 组织。因此，它们不能准确反映患者治疗反应和肿瘤细胞?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究得到了 Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud （PT20/00045）、欧盟地平线 2020 研究和创新计划资助的资助，根据第 857381 号赠款协议，项目 VISION（加强胃肠道癌症早期诊断的科学卓越和创新能力的战略）， 为临床研究人员和新兴研究小组 IRYCIS （2021/0446）、患者衍生类器官 2.0 项目 （CIBERONC） 和 TRANSCAN II 项目征集新研究项目 JTC 2017 呼吁“建立胰腺神经内分泌肿瘤患者早期诊断和随访的算法 （NExT）”，批准号 1.1.1.5/ERANET/20/03。本协议中使用的生物样本由Ramón y Cajal-IRYCIS生物银行医院（B.0000678）提供，并集成到ISCIII（PT20/00045）的生物样本库和生物模型平台中。我们还要感谢 Yvonne Kohl、Agapi Kataki Vita Rovita 和 Thorsten Knoll 对开发该协议作为 NExT 和 VISION 项目的一部分的宝贵支持。

Materials

6 well Costar Ultra-low Attachment plates Biofil TCP011006
70 μm pore strainer VWR 732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer Gibco A10492-01
Amphotericin B Gibco 15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) Nuaire NU-4750E
Cell recovery solution Corning  354253
Collagenase IV Gibco 17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES Gibco 31330-038
DNase Roche 10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-079-CV
Freezing container, Nalgene Merck C1562
gentleMACS Octo Dissociator Milteny Biotec 130-096-427
HEPES Gibco 15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF) enQuireBio QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice Janvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Invitrogen RP10931
L-Glutamine Corning 354235
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning 356234
Normocin InvivoGen ant-nr-2
Pasteur pipettes Deltalab 200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x) Corning 30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Gibco PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Gibco PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL 72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501
Surgical Blades Nahita FMB018
Trypsin Gibco 25300054
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Díaz-Alejo, J. F., April-Monn, S., Cihova, M., Buocikova, V., Villalón López, J., Urbanova, M., Lechuga, C. G., Tomas, M., Dubovan, P., Sánchez, B. L., Páez, S. C., Sanjuanbenito, A., Lobo, E., Romio de la Heras, E., Guerra, C., de la Pinta, C., Barreto Melian, E., Rodríguez Garrote, M., Carrato, A., Ruiz-Cañas, L., Sainz, Jr., B., Torres, A., Smolkova, B., Earl, J. Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue. J. Vis. Exp. (195), e65229, doi:10.3791/65229 (2023).
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