Etablering af tumororganoider og fibroblaster afledt af kræft i bugspytkirtlen fra frisk væv
Summary
Tumororganoider har revolutioneret kræftforskning og tilgangen til personlig medicin. De repræsenterer en klinisk relevant tumormodel, der gør det muligt for forskere at være et skridt foran tumoren i klinikken. Denne protokol etablerer tumororganoider fra friske pancreas tumorvævsprøver og patientafledte xenotransplantater af pancreas adenocarcinom oprindelse.
Abstract
Tumororganoider er tredimensionelle (3D) ex vivo tumormodeller, der rekapitulerer de biologiske nøglefunktioner i de oprindelige primære tumorvæv. Patientafledte tumororganoider er blevet anvendt i translationel kræftforskning og kan anvendes til at vurdere behandlingsfølsomhed og resistens, celle-celle-interaktioner og tumorcelleinteraktioner med tumormikromiljøet. Tumororganoider er komplekse kultursystemer, der kræver avancerede cellekulturteknikker og kulturmedier med specifikke vækstfaktorcocktails og en biologisk kældermembran, der efterligner det ekstracellulære miljø. Evnen til at etablere primære tumorkulturer afhænger i høj grad af oprindelsesvævet, cellulariteten og tumorens kliniske egenskaber, såsom tumorkvaliteten. Desuden er indsamling af vævsprøver, materialekvalitet og -kvantitet samt korrekt biobanking og opbevaring afgørende elementer i denne procedure. Laboratoriets tekniske evner er også afgørende faktorer at overveje. Her rapporterer vi en valideret SOP/protokol, der er teknisk og økonomisk gennemførlig til dyrkning af ex vivo tumororganoider fra friske vævsprøver af pancreas adenocarcinom-oprindelse, enten fra frisk primært resekteret patientdonorvæv eller patientafledte xenotransplantater (PDX). Teknikken beskrevet heri kan udføres i laboratorier med grundlæggende vævskultur og musefaciliteter og er skræddersyet til bred anvendelse inden for translationel onkologi.
Introduction
Tumororganoider er ex vivo tredimensionelle (3D) organiserede kulturer, der stammer fra frisk tumorvæv og giver kræftmodeller. Tumororganoider rekapitulerer de biologiske nøgleegenskaber ved den oprindelige primære tumor 1,2,3,4 og kan udvides i op til flere måneder og kryopræserveres, svarende til konventionelle udødeliggjorte cellelinjer. Tumororganoider giver en biobank med patientafledte tumormodeller til translationel / personlig medicin5 og repræsenterer et vigtigt fremskridt inden for kræftcellebiologiske systemer / modeller. Patientafledte tumororganoider kan anvendes som ex vivo-modeller til at forudsige effekten af (neo)adjuverende onkologiske/farmakologiske behandlinger, for hvilke kulturer er etableret ud fra frisk tumorvæv, og lægemiddelfølsomhedsanalyser eller farmakotypning udføres på patientspecifik basis for at identificere effektive midler til efterfølgende behandlingslinjer 1,4. Desuden overvinder tumororganoider begrænsningen af tilgængeligheden af primært tumorvæv og, endnu vigtigere, giver et fremragende alternativ eller komplementært system til in vivo-musemodeller, såsom patientafledte xenotransplantater (PDX)2. Kompleksiteten af tumororganoider øges, hvis de primære tumorceller kombineres med stromale celler, der findes i tumormikromiljøet (TME), såsom kræftassocierede fibroblaster (CAF’er), endotelceller og immunceller, som efterligner funktionen og den komplekse cellularitet af den primære tumor. Tumororganoider er blevet etableret for mange tumortyper ved hjælp af standardiserede protokoller 6,7,8,9,10. Organoid formering fra forskellige faste tumorer, herunder kolorektal og brystkræftvæv, er veletableret og teknisk overkommelig 11,12,13,14,15.
Kirurgiske tumorresektioner eller tumorbiopsier giver primære tumorvævsprøver. Ideelt set bør tumorvævsprøver komme fra midten af tumormassen eller den invaderende kant af tumoren såvel som normalt udseende væv ved siden af tumoren. Sammenlignet med konventionelle 2D-kulturer kræver tumororganoider flere “add-ons”, herunder en biologisk kældermembran (såsom Matrigel, hydrogel eller et kollagenbaseret stillads), som efterligner den ekstracellulære TME og et flydende vækstmedium, der leverer specifikke næringsstoffer og vækstfaktorer og understøtter celleproliferation og levedygtighed i kultur16.
De mest grundlæggende trin i primær cellekultur er vask af vævet i saltopløsning for at forhindre forurening, mekanisk skæring / fordøjelse af tumoren i små stykker på 1-3 mm3 og behandling med kollagenase til enzymatisk fordøjelse af vævet. Den fordøjede blanding filtreres derefter for at fjerne store vævsfragmenter, resuspenderes i en biologisk kældermembran såsom Matrigel og belægges som kupler i kulturplader med lav vedhæftning for at forbedre ikke-vedhæftningsvækst. Kældermembranmatrixkuplerne er dækket med flydende kulturmedium og suppleret med glutamin og antibiotika for at undgå forurening samt med specifikke vækstfaktorer afhængigt af vævstypen 7,8,9,16,17. Andre relevante celler, der er til stede i bulktumoren og TME, kan også isoleres, såsom kræftassocierede fibroblaster (CAF’er) og immunceller. Denne teknik, som for nylig er blevet gennemgået18, tillader etablering af co-kulturer med forskellige celletyper for at studere responsen på terapi i et mere “realistisk” tumormiljø. Desuden kan celle-celle-interaktioner og interaktionen mellem tumorceller og komponenter i den omgivende biologiske matrix undersøges.
Den rapporterede succesrate for tumororganoidetablering ved hjælp af frisk væv fra biopsier eller resekteret gastrointestinalt tumorvæv er omkring 50%11, og succesraten fra sidstnævnte afhænger i høj grad af vævstypen og oprindelsen4, især tumorkvaliteten og den samlede tumorcellularitet. Tredimensionelle tumormodeller har varierende kompleksitet, fra simple encellede aggregater til meget komplekse konstruerede modeller bestående af forskellige celletyper. Terminologien, der bruges til at beskrive 3D-kulturer i litteraturen, er meget inkonsekvent 19,20,21, da forskellige udtryk som sfæroider, tumorsfærer og organoider anvendes, selvom forskellen mellem dem er uklar. Da der endnu ikke er opnået en klar konsensus om definitionen, beskrives en tumororganoid i denne artikel som en organiseret tumorcellekultur indlejret i en biologisk kældermembran.
Heri rapporteres en valideret protokol til etablering af tumororganoider fra friske vævsprøver, der stammer fra frisk primær resekteret eller PDX-afledt pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), og denne protokol kan udføres i de fleste laboratorier med basale vævskulturfaciliteter. Denne protokol er blevet tilpasset fra flere state-of-the-art rapporterede protokoller, der i øjeblikket bruges til at etablere tumororganoider eller tumoroider fra fordøjelsestumorvæv fra grupperne David Tuveson9, Hans Clevers8 og Aurel Perren7.
Denne protokol diskuterer ikke, hvordan det friske væv høstes. For at opnå frisk humant tumorvæv af høj kvalitet er det vigtigt at have effektiv koordinering mellem kirurgerne, der høster vævet, og patologiafdelingen, der ekstraherer vævsprøven til organoidkultur. Ligeledes, når du bruger PDX som en frisk vævskilde, er effektiv koordinering med den person, der høster vævsprøven, også vigtig. Det er afgørende at få vævsprøven så hurtigt som muligt (inden for 30-60 min fra høsttidspunktet) for at opretholde en høj kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Store fremskridt inden for farmakologiske kræftbehandlinger er udfordrende, da sandsynligheden for godkendelse af lægemidler i fase I onkologiske kliniske forsøg er 5,1%, hvilket er den laveste af alle sygdomstyper23. Hovedårsagen er, at kræft er meget heterogen, og derfor reagerer patientkohorter ikke ensartet som forventet på den givne behandling, hvilket understreger, at der er behov for en mere personlig tilgang. Todimensionelle (2D) kulturer er blevet brugt i translationel kræftforskni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Den Europæiske Unions Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 857381, projekt VISION (Strategies to strengthen scientific excellence and innovation capacity for early diagnosis of gastrointestinal cancers), Intramural call til nye forskningsprojekter for kliniske forskere og nye forskningsgrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) og TRANSCAN II projektet JTC 2017 call “Etablering af en algoritme til tidlig diagnose og opfølgning af patienter med pancreas neuroendokrine tumorer (NExT)”, bevillingsnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiske prøver, der anvendes i denne protokol, blev leveret af BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) og integreret i ISCIII’s Biobanks and Biomodels Platform (PT20/00045). Vi vil også gerne takke Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita og Thorsten Knoll for deres uvurderlige støtte til at udvikle denne protokol som en del af NExT- og VISION-projekterne.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
