Costituzione di organoidi e fibroblasti tumorali derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco
Summary
Gli organoidi tumorali hanno rivoluzionato la ricerca sul cancro e l’approccio alla medicina personalizzata. Rappresentano un modello tumorale clinicamente rilevante che consente ai ricercatori di stare un passo avanti rispetto al tumore in clinica. Questo protocollo stabilisce organoidi tumorali da campioni di tessuto tumorale pancreatico fresco e xenotrapianti derivati da pazienti di origine adenocarcinoma pancreatica.
Abstract
Gli organoidi tumorali sono modelli tumorali tridimensionali (3D) ex vivo che ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave dei tessuti tumorali primari originali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono stati utilizzati nella ricerca traslazionale sul cancro e possono essere applicati per valutare la sensibilità e la resistenza al trattamento, le interazioni cellula-cellula e le interazioni delle cellule tumorali con il microambiente tumorale. Gli organoidi tumorali sono sistemi di coltura complessi che richiedono tecniche avanzate di coltura cellulare e terreni di coltura con cocktail di fattori di crescita specifici e una membrana basale biologica che imita l’ambiente extracellulare. La capacità di stabilire colture tumorali primarie dipende fortemente dal tessuto di origine, dalla cellularità e dalle caratteristiche cliniche del tumore, come il grado del tumore. Inoltre, la raccolta dei campioni di tessuto, la qualità e la quantità dei materiali, nonché la corretta biobanca e conservazione sono elementi cruciali di questa procedura. Anche le capacità tecniche del laboratorio sono fattori cruciali da considerare. In questo articolo, riportiamo una SOP/protocollo convalidato che è tecnicamente ed economicamente fattibile per la coltura di organoidi tumorali ex vivo da campioni di tessuto fresco di origine adenocarcinoma pancreatica, sia da tessuto di donatore paziente primario fresco resecato che da xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). La tecnica qui descritta può essere eseguita in laboratori con colture tissutali di base e strutture murine ed è adattata per un’ampia applicazione nel campo dell’oncologia traslazionale.
Introduction
Gli organoidi tumorali sono colture organizzate tridimensionali (3D) ex vivo derivate da tessuto tumorale fresco e forniscono modelli di cancro. Gli organoidi tumorali ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave del tumore primario originale 1,2,3,4 e possono essere espansi fino a diversi mesi e crioconservati, in modo simile alle linee cellulari immortalizzate convenzionali. Gli organoidi tumorali forniscono una biobanca di modelli tumorali derivati da pazienti per la medicina traslazionale/personalizzata5 e rappresentano un importante progresso nei sistemi/modelli di biologia delle cellule tumorali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti possono essere utilizzati come modelli ex vivo per prevedere l’efficacia delle terapie oncologiche/farmacologiche (neo)adiuvanti, per le quali vengono stabilite colture da tessuto tumorale fresco e vengono eseguiti saggi di sensibilità ai farmaci o farmacotipizzazione su base paziente-specifica per identificare agenti efficaci per le successive linee di terapia 1,4. Inoltre, gli organoidi tumorali superano i limiti della disponibilità di tessuto tumorale primario e, cosa più importante, forniscono un eccellente sistema alternativo o complementare ai modelli murini in vivo, come gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)2. La complessità degli organoidi tumorali aumenta se le cellule tumorali primarie sono combinate con le cellule stromali che si trovano nel microambiente tumorale (TME), come i fibroblasti associati al cancro (CAF), le cellule endoteliali e le cellule immunitarie, che imitano il funzionamento e la complessa cellularità del tumore primario. Gli organoidi tumorali sono stati stabiliti per molti tipi di tumore utilizzando i protocolli standardizzati 6,7,8,9,10. La propagazione degli organoidi da diversi tumori solidi, tra cui il tessuto del cancro del colon-retto e della mammella, è ben consolidata e tecnicamente conveniente 11,12,13,14,15.
Le resezioni chirurgiche del tumore o le biopsie tumorali forniscono campioni di tessuto tumorale primario. Idealmente, i campioni di tessuto tumorale dovrebbero provenire dal centro della massa tumorale o dal bordo invasore del tumore, nonché dal tessuto dall’aspetto normale adiacente al tumore. Rispetto alle colture 2D convenzionali, gli organoidi tumorali richiedono diversi “componenti aggiuntivi”, tra cui una membrana basale biologica (come Matrigel, idrogel o un’impalcatura a base di collagene), che imita la TME extracellulare, e un terreno di crescita liquido che fornisce nutrienti e fattori di crescita specifici e supporta la proliferazione e la vitalità cellulare in coltura16.
Le fasi più basilari della coltura cellulare primaria sono il lavaggio del tessuto in soluzione salina per prevenire la contaminazione, il taglio/digestione meccanica del tumore in piccoli pezzi di 1-3mm3 e il trattamento con collagenasi per la digestione enzimatica del tessuto. La miscela digerita viene quindi filtrata per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni, risospesa in una membrana basale biologica come Matrigel e placcata come cupole in piastre di coltura a basso attaccamento per migliorare la crescita senza attaccamento. Le cupole della matrice della membrana basale sono ricoperte con terreno di coltura liquido e integrate con glutammina e antibiotici per evitare contaminazioni, nonché con fattori di crescita specifici a seconda del tipo di tessuto 7,8,9,16,17. Possono essere isolate anche altre cellule rilevanti presenti all’interno del tumore di massa e della TME, come i fibroblasti associati al cancro (CAF) e le cellule immunitarie. Questa tecnica, che è stata recentemente rivista18, consente la costituzione di co-colture con diversi tipi cellulari per studiare la risposta alla terapia in un ambiente tumorale più “realistico”. Inoltre, possono essere studiate le interazioni cellula-cellula e l’interazione tra cellule tumorali e componenti della matrice biologica circostante.
Il tasso di successo riportato per l’insediamento di organoidi tumorali utilizzando tessuto fresco proveniente da biopsie o tessuto tumorale gastrointestinale resecato è di circa il 50%11 e il tasso di successo di quest’ultimo dipende in gran parte dal tipo di tessuto e dall’origine4, in particolare dal grado del tumore e dalla cellularità complessiva del tumore. I modelli tumorali tridimensionali hanno una complessità variabile, da semplici aggregati unicellulari a modelli ingegnerizzati altamente complessi costituiti da vari tipi di cellule. La terminologia utilizzata per descrivere le culture 3D in letteratura è altamente incoerente 19,20,21, poiché vengono utilizzati termini diversi come sferoidi, tumoresfere e organoidi, sebbene la differenza tra loro non sia chiara. Poiché non è stato ancora raggiunto un chiaro consenso sulla definizione, in questo articolo, un organoide tumorale è descritto come una coltura cellulare tumorale organizzata incorporata in una membrana basale biologica.
In questo documento, viene riportato un protocollo convalidato per la creazione di organoidi tumorali da campioni di tessuto fresco provenienti da adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) primario resecato o derivato da PDX, e questo protocollo può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori con strutture di coltura tissutale di base. Questo protocollo è stato adattato da diversi protocolli all’avanguardia che sono attualmente utilizzati per stabilire organoidi tumorali o tumoroidi da tessuto tumorale digestivo dei gruppi di David Tuveson9, Hans Clevers8 e Aurel Perren7.
Questo protocollo non discute il modo in cui il tessuto fresco viene raccolto. Per ottenere tessuto tumorale umano fresco di alta qualità, è importante avere un coordinamento efficiente tra i chirurghi che prelevano il tessuto e il reparto di patologia che estrae il campione di tessuto per la coltura di organoidi. Allo stesso modo, quando si utilizza PDX come fonte di tessuto fresco, è importante anche un coordinamento efficiente con la persona che raccoglie il campione di tessuto. È fondamentale ottenere il campione di tessuto il più rapidamente possibile (entro 30-60 minuti dal momento del prelievo) per mantenere un’elevata qualità.
Protocol
Representative Results
Discussion
I principali progressi nelle terapie farmacologiche antitumorali sono impegnativi, poiché la probabilità di approvazione dei farmaci negli studi clinici oncologici di fase I è del 5,1%, che è la più bassa di tutti i tipi di malattia23. Il motivo principale è che il cancro è molto eterogeneo e, pertanto, le coorti di pazienti non rispondono uniformemente come previsto al trattamento dato, il che evidenzia la necessità di un approccio più personalizzato. Le colture bidimensionali (2D) sono …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea nell’ambito della convenzione di sovvenzione n. 857381, dal progetto VISION (Strategie per rafforzare l’eccellenza scientifica e la capacità di innovazione per la diagnosi precoce dei tumori gastrointestinali), Bando intramurale per nuovi progetti di ricerca per ricercatori clinici e gruppi di ricerca emergenti IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) e il progetto TRANSCAN II JTC 2017 call “Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreatic neuroendocrine tumours (NExT)”, grant number 1.1.1.5/ERANET/20/03. I campioni biologici utilizzati in questo protocollo sono stati forniti dalla Biobanca Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integrati nella Piattaforma Biobanche e Biomodelli dell’ISCIII (PT20/00045). Vorremmo anche ringraziare Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita e Thorsten Knoll per il loro prezioso supporto allo sviluppo di questo protocollo nell’ambito dei progetti NExT e VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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