Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması
Summary
Tümör organoidleri, kanser araştırmalarında ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımında devrim yarattı. Araştırmacıların klinikte tümörden bir adım önde olmalarını sağlayan klinik olarak ilgili bir tümör modelini temsil ederler. Bu protokol, taze pankreas tümör dokusu örneklerinden ve pankreas adenokarsinomu kökenli hasta kaynaklı ksenogreftlerden tümör organoidlerini oluşturur.
Abstract
Tümör organoidleri, orijinal primer tümör dokularının biyolojik temel özelliklerini özetleyen üç boyutlu (3D) ex vivo tümör modelleridir. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, translasyonel kanser araştırmalarında kullanılmıştır ve tedavi duyarlılığını ve direncini, hücre-hücre etkileşimlerini ve tümör mikroçevresi ile tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir. Tümör organoidleri, gelişmiş hücre kültürü teknikleri ve spesifik büyüme faktörü kokteylleri ve hücre dışı ortamı taklit eden biyolojik bir bazal membran içeren kültür ortamı gerektiren karmaşık kültür sistemleridir. Primer tümör kültürlerini oluşturma yeteneği büyük ölçüde orijin dokusuna, hücreselliğe ve tümörün tümör derecesi gibi klinik özelliklerine bağlıdır. Ayrıca, doku örneği toplama, malzeme kalitesi ve miktarının yanı sıra doğru biyobankacılık ve depolama bu prosedürün çok önemli unsurlarıdır. Laboratuvarın teknik özellikleri de dikkate alınması gereken çok önemli faktörlerdir. Burada, pankreas adenokarsinomu orijinli taze doku örneklerinden, taze primer rezeke edilmiş hasta donör dokusundan veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden (PDX) ex vivo tümör organoidlerinin kültürü için teknik ve ekonomik olarak uygulanabilir olan doğrulanmış bir SOP/protokol sunuyoruz. Burada açıklanan teknik, temel doku kültürü ve fare olanaklarına sahip laboratuvarlarda gerçekleştirilebilir ve translasyonel onkoloji alanında geniş uygulama için uyarlanmıştır.
Introduction
Tümör organoidleri, taze tümör dokusundan türetilen ve kanser modelleri sağlayan ex vivo üç boyutlu (3D) organize kültürlerdir. Tümör organoidleri, orijinal primer tümörün 1,2,3,4 biyolojik temel özelliklerini özetler ve geleneksel ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına benzer şekilde birkaç aya kadar genişletilebilir ve dondurularak saklanabilir. Tümör organoidleri, translasyonel/kişiselleştirilmiş tıp5 için hasta kaynaklı tümör modellerinin bir biyobankasını sağlar ve kanser hücresi biyolojisi sistemlerinde/modellerinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, kültürlerin taze tümör dokusundan oluşturulduğu ve ilaç duyarlılık testlerinin veya farmakotiplemenin sonraki tedavi hatları için etkili ajanları belirlemek için hastaya özgü bazda gerçekleştirildiği (neo)adjuvan onkolojik/farmakolojik tedavilerin etkinliğini tahmin etmek için ex vivo modeller olarak kullanılabilir 1,4. Ayrıca, tümör organoidleri, primer tümör dokusunun mevcudiyeti sınırlamasının üstesinden gelir ve daha da önemlisi, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo fare modellerine mükemmel bir alternatif veya tamamlayıcı sistem sağlar2. Primer tümör hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF’ler), endotel hücreleri ve primer tümörün işleyişini ve karmaşık hücreselliğini taklit eden bağışıklık hücreleri gibi tümör mikroçevresinde (TME) bulunan stromal hücrelerle birleştirilirse, tümör organoidlerinin karmaşıklığı artar. Tümör organoidleri, standartprotokoller 6,7,8,9,10 kullanılarak birçok tümör tipi için oluşturulmuştur. Kolorektal ve meme kanseri dokusu dahil olmak üzere farklı katı tümörlerden organoid yayılımı, köklü ve teknik olarak uygun maliyetlidir 11,12,13,14,15.
Cerrahi tümör rezeksiyonları veya tümör biyopsileri, primer tümör dokusu örnekleri sağlar. İdeal olarak, tümör dokusu örnekleri, tümör kitlesinin merkezinden veya tümörün istilacı kenarından ve ayrıca tümöre bitişik normal görünümlü dokudan gelmelidir. Geleneksel 2D kültürlerle karşılaştırıldığında, tümör organoidleri, hücre dışı TME’yi taklit eden biyolojik bir bazal membran (Matrigel, hidrojel veya kollajen bazlı bir iskele gibi) ve spesifik besinler ve büyüme faktörleri sağlayan ve kültürde hücre proliferasyonunu ve canlılığını destekleyen bir sıvı büyüme ortamı dahil olmak üzere birkaç “eklenti” gerektirir16.
Primer hücre kültüründe en temel adımlar, kontaminasyonu önlemek için dokunun salin solüsyonunda yıkanması, tümörün mekanik olarak 1-3mm3’lük küçük parçalara kesilmesi/sindirilmesi ve dokunun enzimatik sindirimi için kollajenaz ile muamele edilmesidir. Sindirilmiş karışım daha sonra büyük doku parçalarını çıkarmak için süzülür, Matrigel gibi biyolojik bir bazal membranda yeniden süspanse edilir ve bağlanmayan büyümeyi arttırmak için düşük bağlı kültür plakalarında kubbeler olarak kaplanır. Bazal membran matris kubbeleri, sıvı kültür ortamı ile kaplanır ve kontaminasyonu önlemek için glutamin ve antibiyotiklerin yanı sıradoku tipine bağlı olarak spesifik büyüme faktörleri ile desteklenir 7,8,9,16,17. Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF’ler) ve bağışıklık hücreleri gibi toplu tümör ve TME içinde bulunan diğer ilgili hücreler de izole edilebilir. Yakın zamanda gözden geçirilen bu teknik,18, daha “gerçekçi” bir tümör ortamında tedaviye yanıtı incelemek için farklı hücre tiplerine sahip ko-kültürlerin kurulmasına izin verir. Ayrıca, hücre-hücre etkileşimleri ve tümör hücreleri ile çevredeki biyolojik matrisin bileşenleri arasındaki etkileşim incelenebilir.
Biyopsilerden veya rezeke edilen gastrointestinal tümör dokusundan alınan taze doku kullanılarak tümör organoid oluşumunun bildirilen başarı oranı %50 civarındadır11 ve ikincisinden elde edilen başarı oranı büyük ölçüde doku tipine ve orijine4, özellikle tümör derecesine ve genel tümör hücreselliğine bağlıdır. Üç boyutlu tümör modelleri, basit tek hücreli agregalardan çeşitli hücre tiplerinden oluşan oldukça karmaşık mühendislik modellerine kadar değişen karmaşıklıklara sahiptir. Literatürde 3D kültürleri tanımlamak için kullanılan terminoloji oldukça tutarsızdır 19,20,21, çünkü aralarındaki fark belirsiz olsa da, sferoidler, tümör küreleri ve organoidler gibi farklı terimler kullanılmaktadır. Tanım üzerinde henüz net bir fikir birliğine varılamadığından, bu makalede bir tümör organoidi, biyolojik bir bazal membrana gömülü organize bir tümör hücre kültürü olarak tanımlanmaktadır.
Burada, taze primer rezeke edilmiş veya PDX kaynaklı pankreatik duktal adenokarsinomdan (PDAC) kaynaklanan taze doku örneklerinden tümör organoidlerinin oluşturulması için onaylanmış bir protokol bildirilmiştir ve bu protokol temel doku kültürü olanaklarına sahip çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu protokol, şu anda David Tuveson9, Hans Clevers8 ve Aurel Perren7 gruplarından sindirim tümörü dokusundan tümör organoidleri veya tümöroidleri oluşturmak için kullanılan son teknoloji rapor edilmiş birkaç protokolden uyarlanmıştır.
Bu protokol, taze dokunun nasıl toplandığını tartışmaz. Yüksek kaliteli taze insan tümör dokusu elde etmek için, dokuyu toplayan cerrahlar ile organoid kültür için doku örneğini çıkaran patoloji departmanı arasında verimli bir koordinasyona sahip olmak önemlidir. Benzer şekilde, PDX’i taze doku kaynağı olarak kullanırken, doku örneğini alan kişiyle etkili koordinasyon da önemlidir. Yüksek kaliteyi korumak için doku örneğini mümkün olduğunca çabuk (hasat zamanından itibaren 30-60 dakika içinde) elde etmek çok önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farmakolojik kanser tedavilerindeki büyük ilerlemeler zordur, çünkü faz I onkoloji klinik çalışmalarında ilaçların onaylanma olasılığı tüm hastalık türleri arasında en düşük olan %5.1’dir23. Bunun ana nedeni, kanserin çok heterojen olması ve bu nedenle hasta kohortlarının verilen tedaviye beklendiği gibi tek tip yanıt vermemesidir, bu da daha kişiselleştirilmiş bir yaklaşıma ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. İki boyutlu (2D) kültürler, translasyonel kanser ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı olan Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), 857381 No’lu hibe sözleşmesi kapsamında Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı, VISION (Gastrointestinal kanserlerin erken teşhisi için bilimsel mükemmellik ve inovasyon kapasitesini güçlendirme stratejileri) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Klinik araştırmacılar ve gelişmekte olan araştırma grupları için yeni araştırma projeleri için intramural çağrı IRYCIS (2021/0446), Hasta Kaynaklı Organoidler 2.0 Projesi (CIBERONC) ve TRANSCAN II projesi JTC 2017 çağrısı “Pankreas nöroendokrin tümörleri (NExT) olan hastaların erken tanısı ve takibi için bir algoritma oluşturulması”, hibe numarası 1.1.1.5/ERANET/20/03. Bu protokolde kullanılan biyolojik örnekler, BioBank Hastanesi Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) tarafından sağlanmış ve ISCIII’nin Biyobankalar ve Biyomodeller Platformuna (PT20/00045) entegre edilmiştir. Ayrıca Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita ve Thorsten Knoll’a NExT ve VISION projelerinin bir parçası olarak bu protokolün geliştirilmesine verdikleri paha biçilmez destek için teşekkür ederiz.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
