Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe
Summary
Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.
Abstract
Tumororganoide sind dreidimensionale (3D) ex vivo Tumormodelle, die die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen primären Tumorgewebes rekapitulieren. Von Patienten stammende Tumororganoide wurden in der translationalen Krebsforschung verwendet und können zur Beurteilung der Behandlungsempfindlichkeit und -resistenz, der Zell-Zell-Interaktionen und der Tumorzellinteraktionen mit der Tumormikroumgebung eingesetzt werden. Tumor-Organoide sind komplexe Kultursysteme, die fortschrittliche Zellkulturtechniken und Nährmedien mit spezifischen Wachstumsfaktor-Cocktails und einer biologischen Basalmembran erfordern, die die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Die Fähigkeit, primäre Tumorkulturen zu etablieren, hängt stark vom Ursprungsgewebe, der Zellularität und den klinischen Merkmalen des Tumors, wie z. B. dem Tumorgrad, ab. Darüber hinaus sind die Entnahme von Gewebeproben, die Materialqualität und -quantität sowie das korrekte Biobanking und die Lagerung entscheidende Elemente dieses Verfahrens. Auch die technischen Möglichkeiten des Labors sind entscheidende Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt. Hier berichten wir über ein validiertes SOP/Protokoll, das technisch und wirtschaftlich für die Kultivierung von ex vivo Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben des Pankreas-Adenokarzinoms geeignet ist, entweder aus frischem primär reseziertem Patientenspendergewebe oder patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Die hier beschriebene Technik kann in Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultur- und Mauseinrichtungen durchgeführt werden und ist auf eine breite Anwendung im Bereich der translationalen Onkologie zugeschnitten.
Introduction
Tumor-Organoide sind ex vivo dreidimensionale (3D) organisierte Kulturen, die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden und Krebsmodelle liefern. Tumor-Organoide rekapitulieren die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen Primärtumors 1,2,3,4 und können, ähnlich wie herkömmliche immortalisierte Zelllinien, für bis zu mehrere Monate expandiert und kryokonserviert werden. Tumororganoide stellen eine Biobank von patientenabgeleiteten Tumormodellen für die translationale/personalisierte Medizin dar5 und stellen einen wichtigen Fortschritt in den Systemen und Modellen der Krebszellbiologie dar. Patienten-abgeleitete Tumor-Organoide können als Ex-vivo-Modelle verwendet werden, um die Wirksamkeit von (neo)adjuvanten onkologischen/pharmakologischen Therapien vorherzusagen, für die Kulturen aus frischem Tumorgewebe etabliert und Arzneimittelsensitivitätsassays oder Pharmakotypisierungen patientenspezifisch durchgeführt werden, um wirksame Wirkstoffe für nachfolgende Therapielinien zu identifizieren 1,4. Darüber hinaus überwinden Tumororganoide die Begrenzung der Verfügbarkeit von primärem Tumorgewebe und, was noch wichtiger ist, sie bieten eine hervorragende Alternative oder Ergänzung zu In-vivo-Mausmodellen, wie z. B. patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX)2. Die Komplexität von Tumororganoiden wird erhöht, wenn die primären Tumorzellen mit Stromazellen kombiniert werden, die sich in der Tumormikroumgebung (TME) befinden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), Endothelzellen und Immunzellen, die die Funktionsweise und komplexe Zellularität des Primärtumors nachahmen. Tumor-Organoide wurden für viele Tumorarten unter Verwendung standardisierter Protokolle 6,7,8,9,10 etabliert. Die Vermehrung von Organoiden aus verschiedenen soliden Tumoren, einschließlich Darm- und Brustkrebsgewebe, ist gut etabliert und technisch erschwinglich 11,12,13,14,15.
Chirurgische Tumorresektionen oder Tumorbiopsien liefern primäre Tumorgewebeproben. Im Idealfall sollten Tumorgewebeproben aus dem Zentrum der Tumormasse oder dem eindringenden Rand des Tumors sowie aus normal aussehendem Gewebe in der Nähe des Tumors stammen. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen benötigen Tumororganoide mehrere “Add-ons”, darunter eine biologische Basalmembran (wie Matrigel, Hydrogel oder ein kollagenbasiertes Gerüst), die das extrazelluläre TME nachahmt, und ein flüssiges Wachstumsmedium, das spezifische Nährstoffe und Wachstumsfaktoren liefert und die Zellproliferation und Lebensfähigkeit in Kultur unterstützt16.
Die grundlegendsten Schritte in der primären Zellkultur sind das Waschen des Gewebes in Kochsalzlösung, um eine Kontamination zu verhindern, das mechanische Schneiden/Verdauen des Tumors in kleine Stücke von 1-3mm3 und die Behandlung mit Kollagenase für die enzymatische Verdauung des Gewebes. Die verdaute Mischung wird dann filtriert, um große Gewebefragmente zu entfernen, in einer biologischen Basalmembran wie Matrigel resuspendiert und als Kuppeln in Kulturplatten mit geringer Anhaftung plattiert, um das Wachstum ohne Anhaftung zu fördern. Die Membran-Kuppeln der Basalmembran sind mit flüssigem Nährmedium bedeckt und mit Glutamin und Antibiotika ergänzt, um eine Kontamination zu vermeiden, sowie mit spezifischen Wachstumsfaktoren je nach Gewebetyp 7,8,9,16,17. Andere relevante Zellen, die innerhalb des Massentumors und der TME vorhanden sind, können ebenfalls isoliert werden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) und Immunzellen. Diese Technik, die kürzlich überprüft wurde18, ermöglicht die Etablierung von Kokulturen mit verschiedenen Zelltypen, um das Ansprechen auf die Therapie in einer “realistischeren” Tumorumgebung zu untersuchen. Darüber hinaus können Zell-Zell-Interaktionen und die Interaktion zwischen Tumorzellen und Komponenten der umgebenden biologischen Matrix untersucht werden.
Die berichtete Erfolgsrate der Etablierung von Tumororganoiden unter Verwendung von frischem Gewebe aus Biopsien oder reseziertem gastrointestinalem Tumorgewebe liegt bei etwa 50 %11, wobei die Erfolgsrate bei letzterem weitgehend vom Gewebetyp undder Herkunft 4 abhängt, insbesondere vom Tumorgrad und der allgemeinen Tumorzellularität. Dreidimensionale Tumormodelle haben eine unterschiedliche Komplexität, von einfachen einzelligen Aggregaten bis hin zu hochkomplexen Modellen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen. Die Terminologie, die in der Literatur zur Beschreibung von 3D-Kulturen verwendet wird, ist höchst inkonsistent 19,20,21, da verschiedene Begriffe wie Sphäroide, Tumorsphären und Organoide verwendet werden, obwohl der Unterschied zwischen ihnen unklar ist. Da ein eindeutiger Konsens über die Definition noch nicht erreicht wurde, wird in diesem Artikel ein Tumororganoid als eine organisierte Tumorzellkultur beschrieben, die in eine biologische Basalmembran eingebettet ist.
Hierin wird ein validiertes Protokoll für die Etablierung von Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben vorgestellt, die aus einem frischen primär resezierten oder PDX-abgeleiteten duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) stammen, und dieses Protokoll kann in den meisten Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultureinrichtungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde von mehreren hochmodernen Protokollen adaptiert, die derzeit verwendet werden, um Tumororganoide oder Tumoroide aus Verdauungstumorgewebe aus den Gruppen von David Tuveson9, Hans Clevers8 und Aurel Perren7 zu etablieren.
In diesem Protokoll wird nicht erläutert, wie das frische Gewebe geerntet wird. Um qualitativ hochwertiges frisches menschliches Tumorgewebe zu erhalten, ist es wichtig, eine effiziente Koordination zwischen den Chirurgen, die das Gewebe entnehmen, und der Pathologieabteilung, die die Gewebeprobe für die Organoidkultur entnimmt, zu haben. Auch bei der Verwendung von PDX als Frischgewebequelle ist eine effiziente Koordination mit der Person, die die Gewebeprobe entnimmt, wichtig. Es ist wichtig, die Gewebeprobe so schnell wie möglich zu erhalten (innerhalb von 30-60 Minuten nach der Entnahme), um eine hohe Qualität aufrechtzuerhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Große Fortschritte in der pharmakologischen Krebstherapie sind eine Herausforderung, da die Wahrscheinlichkeit der Zulassung von Medikamenten in klinischen Phase-I-onkologischen Studien bei 5,1 % liegt, was die niedrigste aller Krankheitsarten ist23. Der Hauptgrund dafür ist, dass Krebs sehr heterogen ist und daher die Patientenkohorten nicht einheitlich wie erwartet auf die jeweilige Behandlung ansprechen, was unterstreicht, dass ein personalisierterer Ansatz erforderlich ist. Zweidimensionale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch die Förderung der Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 857381, Projekt VISION (Strategien zur Stärkung der wissenschaftlichen Exzellenz und Innovationskapazität für die Früherkennung von Magen-Darm-Krebs), Intramurale Ausschreibung für neue Forschungsprojekte für klinische Forscher und aufstrebende Forschungsgruppen IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) und das TRANSCAN II-Projekt JTC 2017 Call “Etablierung eines Algorithmus für die Frühdiagnose und Nachsorge von Patienten mit neuroendokrinen Pankreastumoren (NExT)”, Fördernummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. Die in diesem Protokoll verwendeten biologischen Proben wurden vom BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) zur Verfügung gestellt und in die Biobanken und Biomodellplattform des ISCIII (PT20/00045) integriert. Wir danken auch Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita und Thorsten Knoll für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls im Rahmen der Projekte NExT und VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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