Получение опухолевых органоидов и фибробластов рака поджелудочной железы из свежих тканей
Summary
Органоиды опухолей произвели революцию в исследованиях рака и подходе к персонализированной медицине. Они представляют собой клинически значимую модель опухоли, которая позволяет исследователям оставаться на шаг впереди опухоли в клинике. Этот протокол устанавливает опухолевые органоиды из свежих образцов ткани опухоли поджелудочной железы и ксенотрансплантатов, полученных от пациента при аденокарциноме поджелудочной железы.
Abstract
Опухолевые органоиды представляют собой трехмерные (3D) модели опухолей ex vivo , которые повторяют биологические ключевые особенности исходных первичных опухолевых тканей. Органоиды опухолей, полученные от пациентов, используются в трансляционных исследованиях рака и могут применяться для оценки чувствительности и резистентности к лечению, межклеточных взаимодействий и взаимодействий опухолевых клеток с микроокружением опухоли. Опухолевые органоиды представляют собой сложные системы культивирования, требующие передовых методов культивирования клеток и питательных сред со специфическими коктейлями факторов роста и биологической базальной мембраной, имитирующей внеклеточную среду. Возможность создания первичных опухолевых культур в значительной степени зависит от исходной ткани, клеточности и клинических особенностей опухоли, таких как степень опухоли. Кроме того, важнейшими элементами этой процедуры являются сбор образцов тканей, качество и количество материала, а также правильное биобанкирование и хранение. Технические возможности лаборатории также являются решающими факторами, которые следует учитывать. Здесь мы сообщаем о валидированной СОП/протоколе, который технически и экономически осуществим для культивирования опухолевых органоидов ex vivo из свежих образцов тканей происхождения из аденокарциномы поджелудочной железы, либо из свежей первичной резецированной донорской ткани пациента, либо из ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Описанный здесь метод может быть выполнен в лабораториях с базовыми тканевыми культурами и оборудованием для мышей и адаптирован для широкого применения в области трансляционной онкологии.
Introduction
Опухолевые органоиды представляют собой трехмерные (3D) организованные культуры ex vivo, полученные из свежей опухолевой ткани и обеспечивающие модели рака. Опухолевые органоиды повторяют биологические ключевые особенности исходной первичной опухоли 1,2,3,4 и могут быть расширены на срок до нескольких месяцев и криоконсервированы, подобно обычным иммортализированным клеточным линиям. Органоиды опухолей представляют собой биобанк моделей опухолей, полученных от пациентов, для трансляционной/персонализированной медицины5 и представляют собой важный шаг вперед в системах/моделях биологии раковых клеток. Органоиды опухолей, полученные от пациентов, могут быть использованы в качестве моделей ex vivo для прогнозирования эффективности (нео)адъювантной онкологической/фармакологической терапии, для которой из свежей опухолевой ткани устанавливают культуры и проводят анализы на чувствительность к лекарственным препаратам или фармакотипирование на индивидуальной основе для выявления эффективных агентов для последующих линий терапии 1,4. Кроме того, опухолевые органоиды преодолевают ограниченность доступности первичной опухолевой ткани и, что более важно, представляют собой прекрасную альтернативу или комплементарную систему для мышиных моделей in vivo, таких как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX)2. Сложность опухолевых органоидов увеличивается, если первичные опухолевые клетки сочетаются со стромальными клетками, которые находятся в опухолевом микроокружении (ТМЭ), такими как рак-ассоциированные фибробласты (CAF), эндотелиальные клетки и иммунные клетки, которые имитируют функционирование и сложную клеточность первичной опухоли. Органоиды опухолей были установлены для многих типов опухолей с использованием стандартизированных протоколов 6,7,8,9,10. Размножение органоидов из различных солидных опухолей, включая колоректальную ткань и ткань рака молочной железы, хорошо известно и технически доступно 11,12,13,14,15.
Хирургическая резекция опухоли или биопсия опухоли позволяют получить первичные образцы опухолевой ткани. В идеале образцы опухолевой ткани должны поступать из центра опухолевой массы или вторгающегося края опухоли, а также из нормально выглядящей ткани, прилегающей к опухоли. По сравнению с обычными 2D-культурами, опухолевые органоиды требуют нескольких «дополнений», включая биологическую базальную мембрану (например, матригель, гидрогель или каркас на основе коллагена), которая имитирует внеклеточный TME, и жидкую питательную среду, которая поставляет определенные питательные вещества и факторы роста и поддерживает пролиферацию и жизнеспособность клеток в культуре16.
Наиболее основными этапами первичной клеточной культуры являются промывание тканей в физиологическом растворе для предотвращения загрязнения, механическое разрезание/расщепление опухоли на мелкие кусочки по 1-3мм3 и обработка коллагеназой для ферментативного расщепления ткани. Затем переваренную смесь фильтруют для удаления крупных фрагментов ткани, ресуспендируют в биологической базальной мембране, такой как Matrigel, и покрывают в виде куполов в культуральных планшетах с низким прикреплением для усиления роста без прикрепления. Матричные купола базальной мембраны покрыты жидкой питательной средой и дополнены глютамином и антибиотиками во избежание контаминации, а также специфическими факторами роста в зависимости от типа ткани 7,8,9,16,17. Другие соответствующие клетки, присутствующие в объемной опухоли и TME, также могут быть выделены, такие как ассоциированные с раком фибробласты (CAF) и иммунные клетки. Этот метод, который недавно был рассмотрен18, позволяет создавать кокультуры с различными типами клеток для изучения ответа на терапию в более «реалистичной» опухолевой среде. Кроме того, могут быть изучены межклеточные взаимодействия и взаимодействие между опухолевыми клетками и компонентами окружающего биологического матрикса.
Показатель успешности установления органоидов опухоли с использованием свежей ткани, полученной при биопсии или резецированной опухолевой ткани желудочно-кишечного тракта, составляет около 50%11, а вероятность успеха в последнем случае в значительной степени зависит от типа и происхождения ткани4, в частности, от степени опухоли и общей клеточности опухоли. Трехмерные модели опухолей имеют различную сложность, от простых одноклеточных агрегатов до очень сложных инженерных моделей, состоящих из различных типов клеток. Терминология, используемая для описания 3D-культур в литературе, крайне противоречива 19,20,21, поскольку используются разные термины, такие как сфероиды, опухолевые сферы и органоиды, хотя разница между ними неясна. Поскольку четкого консенсуса по определению еще не достигнуто, в данной статье опухолевый органоид описывается как организованная культура опухолевых клеток, встроенная в биологическую базальную мембрану.
В настоящем документе приводится валидированный протокол для установления опухолевых органоидов из свежих образцов тканей, полученных из свежей первичной резецированной или PDX-протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC), и этот протокол может быть выполнен в большинстве лабораторий, имеющих базовое оборудование для культивирования тканей. Этот протокол был адаптирован из нескольких современных протоколов, которые в настоящее время используются для установления опухолевых органоидов или опухолей из опухолевой ткани пищеварительной системы из групп Дэвида Тувесона9, Ханса Клеверса8 и Ауреля Перрена7.
В этом протоколе не обсуждается, как собирается свежая ткань. Для получения высококачественной свежей опухолевой ткани человека важна эффективная координация между хирургами, которые собирают ткань, и патологоанатомическим отделением, которое извлекает образец ткани для культивирования органоидов. Кроме того, при использовании PDX в качестве источника свежих тканей также важна эффективная координация с человеком, который собирает образец ткани. Очень важно получить образец ткани как можно быстрее (в течение 30-60 минут с момента забора), чтобы сохранить высокое качество.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значительные достижения в фармакологической терапии рака являются сложной задачей, поскольку вероятность одобрения лекарств в клинических исследованиях I фазы онкологии составляет 5,1%, что является самым низким показателем среди всех типов заболевания23. Основная причин?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано финансированием Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 857381, проект VISION (Стратегии укрепления научного превосходства и инновационного потенциала для ранней диагностики рака желудочно-кишечного тракта), Очный конкурс на новые исследовательские проекты для клинических исследователей и новых исследовательских групп IRYCIS (2021/0446), Проект органоидов, полученных из пациентов 2.0 (CIBERONC) и проект TRANSCAN II JTC 2017 «Создание алгоритма ранней диагностики и последующего наблюдения за пациентами с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы (NExT)», номер гранта 1.1.1.5/ERANET/20/03. Биологические образцы, использованные в этом протоколе, были предоставлены больницей BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) и интегрированы в платформу биобанков и биомоделей ISCIII (PT20/00045). Мы также хотели бы поблагодарить Ивонн Коль (Yvonne Kohl), Агапи Катаки (Agapi Kataki Vita Rovita) и Торстена Кнолла (Thorsten Knoll) за их неоценимую поддержку в разработке этого протокола в рамках проектов NExT и VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
