ट्राइकोडर्मा स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया की व्यवहार्यता परख मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के अंदर
Summary
मैक्रोफेज द्वारा फंगल कोनिडिया के फागोसाइटोसिस से जुड़ी तकनीक का व्यापक रूप से कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य ट्राइकोडर्मा स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ प्रेरित मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के फागोसाइटोसिस और निकासी क्षमताओं के मूल्यांकन के लिए एक विधि प्रस्तुत करना है।
Abstract
मैक्रोफेज रक्षा की एक महत्वपूर्ण रेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं और विभिन्न ऊतकों में रोगजनकों के विकास और उपनिवेशण को रोकने के लिए जिम्मेदार हैं। कोनिडियल फागोसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो मैक्रोफेज-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में शामिल साइटोप्लाज्मिक और आणविक घटनाओं की जांच के साथ-साथ आंतरिक कोनिडिया की मृत्यु के समय के निर्धारण के लिए अनुमति देती है। मैक्रोफेज द्वारा फंगल कोनिडिया के फागोसाइटोसिस से जुड़ी तकनीक का व्यापक रूप से कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। फागोसाइटोसिस की चोरी और फागोसोम का पलायन फंगल विषाणु के तंत्र हैं। यहां, हम उन तरीकों की रिपोर्ट करते हैं जिनका उपयोग फागोसाइटोसिस, निकासी और टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया की व्यवहार्यता के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, एक कवक जो जैव नियंत्रण और जैव उर्वरक एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है और मानव संक्रमण को प्रेरित करने में सक्षम है। प्रोटोकॉल में 1) ट्राइकोडर्मा संस्कृति, 2) कोनिडिया प्राप्त करने के लिए धोना, 3) पॉलीसुक्रोज समाधान विधि का उपयोग करके परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का अलगाव और मैक्रोफेज में पीबीएमसी का भेदभाव, 4) गोल ग्लास कवरस्लिप और रंगाई का उपयोग करके इन विट्रो फागोसाइटोसिस विधि में, और 5) कोनिडिया फागोसाइटोसिस के बाद कोनिडिया व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक निकासी परख । सारांश में, इन तकनीकों मैक्रोफेज की कवक निकासी दक्षता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
ट्राइकोडर्मा जीनस (क्रम: हाइपोक्रेलेस, परिवार: हाइपोक्रेसी) सर्वव्यापी, सैप्रोफाइटिक कवक से बना है जो अन्य कवक प्रजातियों के परजीवी हैं और व्यावसायिक रूप से उपयोगीएंजाइमों की एक श्रृंखला का उत्पादन करने में सक्षम हैं। इन कवक प्रजातियों विषम प्रोटीन2 के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है, सेलूलोज़3 के उत्पादन, इथेनॉल, बीयर, शराब, और कागज4, कपड़ा उद्योगमें 5, खाद्य उद्योग6, और जैविक नियंत्रण एजेंटों 7,8 के रूप में कृषि में. इन कवक प्रजातियों में औद्योगिक रुचि के अलावा, मनुष्यों में संक्रमण की बढ़ती संख्या ने कुछ ट्राइकोडर्मा प्रजातियों को अवसरवादीरोगजनकों का दर्जा दिया है।
ट्राइकोडर्मा एसपीपी संस्कृति में तेजी से बढ़ता है, शुरू में सफेद और कपास की कॉलोनियों के साथ जो हरे पीले से गहरे हरे रंग में बदल जाते हैं10. वे पीएच और तापमान की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला में रहने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, और अवसरवादी प्रजातियों शारीरिक पीएच और तापमान पर जीवित रहने में सक्षम हैं और इस प्रकार, विभिन्न मानव ऊतकों 11,12,13 उपनिवेश. महत्वपूर्ण रूप से, ट्राइकोडर्मा एसपीपी की संक्रमण दर में वृद्धि विषाणु कारकों से जुड़ी हो सकती है, और इनका अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया जाता है। इसके अलावा, अवसरवादी ट्राइकोडर्मा प्रजातियों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं।
एक संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल के साथ, मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस के लिए जिम्मेदार रक्षा की रेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस प्रकार, विभिन्न ऊतकों में रोगजनकों के विकास और उपनिवेशण को रोकते हैं। पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, जैसे टोल-जैसे रिसेप्टर्स और सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर्स, मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस कवक का उपयोग करना और उन्हें फागोलिसोसोम में संसाधित करना, इस प्रकार श्वसन फटने को बढ़ावा देना, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई, और फागोसाइटोस्ड सूक्ष्मजीवों का विनाश14. फागोसाइटोसिस का तंत्र, हालांकि, विभिन्न माइक्रोबियल रणनीतियों से प्रभावित और विकसित हो सकता है, जैसे कि कवक कोशिकाओं का आकार और आकार; फागोसाइटोसिस में बाधा डालने वाले कैप्सूल की उपस्थिति; फागोसाइटोसिस-उत्प्रेरण रिसेप्टर्स की संख्या में कमी; साइटोप्लाज्म में एक्टिन फाइबर की संरचना का रीमॉडेलिंग; स्यूडोपोडिया के गठन में बाधा; और फागोसाइटोसिस प्रक्रिया14 के बाद फागोसोम या फागोलिसोसोम बच जाते हैं।
क्रिप्टोकोकस neoformans सहित कई रोगजनकों, मेजबान में जीवित रहने के लिए एक जगह के रूप में मैक्रोफेज का उपयोग करें, प्रसार, और संक्रमण15. फागोसाइटोसिस और निकासी परख रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 15,16,17से बचने के लिए नियोजित माइक्रोबियल रणनीतियों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तकनीक के इस प्रकार भी फागोसाइटोसिस के अंतर कैनेटीक्स की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, फागोसोम अम्लीकरण में देरी, और ऑक्सीडेटिव फट कि कम फंगल हत्या18 में जिसके परिणामस्वरूप.
फागोसाइटोसिस, फंगल अस्तित्व और फागोसोम परिपक्वता प्रक्रिया की चोरी का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इनमें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शामिल है, जिसका उपयोग फागोसाइटोसिस, सेलुलर स्थान और फागोसाइटोसिस19के दौरान उत्पादित अणुओं का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है; फ्लो साइटोमेट्री, जो फागोसाइटोसिस पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है और प्रक्रिया20,21 में शामिल विभिन्न मार्करों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है; इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी, जिसका उपयोग माइक्रोबियल कैप्चर और फागोसोम परिपक्वता22 का आकलन करने के लिए किया जाता है; एंटीबॉडी-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस, जिसका उपयोग रोगज़नक़23 के लिए फागोसाइटोसिस प्रक्रिया की विशिष्टता का आकलन करने के लिए किया जाता है; और अन्य 24,25,26,27।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक आम, कम लागत वाली, और एक ऑप्टिकल खुर्दबीन और थाली विकास परख का उपयोग कर प्रत्यक्ष विधि फागोसाइटोसिस और फंगल conidia की हत्या का आकलन करने के लिए रोजगार. यह प्रोटोकॉल पाठकों को टी. स्ट्रोमैटिकम के संपर्क में आने वाले मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करके फागोसाइटोसिस और क्लीयरेंस परख करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करेगा। पीबीएमसी का उपयोग इसलिए किया गया क्योंकि ट्राइकोडर्मा कोनिडिया को फाइटोपैथोजेन के खिलाफ जैव नियंत्रण के रूप में लागू किया जाता है और दुनिया भर में पौधों की फसलों के लिए एक जैव उर्वरक और कई मानव संक्रमण हुए हैं, जिन्हें ट्राइकोडर्मोसिस कहा जाता है। इसके अलावा, ट्राइकोडर्मा कोनिडिया और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत पर ध्यान केंद्रित करने वाले केवल दो पिछले कार्य हैं, जिसमें हमने मैक्रोफेज29 में न्यूट्रोफिल28 और ऑटोफैगी की जांच की। यह लेख पहले दिखाता है कि पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा टी स्ट्रोमैटिकम के कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का अध्ययन कैसे किया जा सकता है, और फिर सरल माइक्रोस्कोपी-आधारित तकनीकों का उपयोग करके संलग्न कोनिडिया की व्यवहार्यता का आकलन कैसे किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आगे मैक्रोफेज से जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या प्रतिरक्षा प्रणाली मॉड्यूलेशन से संबंधित तंत्र पर जांच की सुविधा प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एस्परगिलस फ्यूमिगेटस, क्रिप्टोकोकस, कैंडिडा अल्बिकन्स और अन्य सहित कई कवक रोगजनकों के लिए, शंकुधारी या खमीर फागोसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो मैक्रोफेज-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को निम्नलिखित ब्राज़ीलियाई वित्तपोषण संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) RED0011/2012 और RED008/2014 के अनुदान के साथ। U.R.S., J.O.C., और M.E.S.M. क्रमशः Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) और FAPESB द्वारा दी गई छात्रवृत्ति को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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