Een procedure voor cryosectie van het ganglion met dorsale wortel van muizen
Summary
Hier wordt de ontwikkeling gepresenteerd voor het consequent verwerven van hoogwaardige cryostaatsecties voor dorsale ganglions.
Abstract
Hoogwaardige cryostatische secties van het dorsale ganglion (DRG) van muizen zijn cruciaal voor een goede immunochemische kleuring en RNAscope-studies bij het onderzoek naar inflammatoire en neuropathische pijn, jeuk en andere perifere neurologische aandoeningen. Het blijft echter een uitdaging om consequent hoogwaardige, intacte en vlakke cryostaatsecties op glasplaatjes te verkrijgen vanwege de kleine steekproefomvang van het DRG-weefsel. Tot nu toe is er geen artikel dat een optimaal protocol voor DRG-cryosecties beschrijft. Dit protocol presenteert een stapsgewijze methode om de vaak voorkomende problemen in verband met DRG-cryosecties op te lossen. In het gepresenteerde artikel wordt uitgelegd hoe u de omringende vloeistof uit de DRG-weefselmonsters kunt verwijderen, de DRG-secties in dezelfde richting op het objectglaasje kunt plaatsen en de secties op het objectglaasje plat kunt maken zonder omhoog te buigen. Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor het cryosectieren van de DRG-monsters, kan het worden toegepast voor het cryosectieren van veel andere weefsels met een kleine steekproefomvang.
Introduction
Het dorsale wortelganglion (DRG) bevat de primaire sensorische neuronen, de weefselmacrofagen en de satellietcellen die de primaire sensorische neuronen omringen 1,2,3,4. Het is een belangrijke anatomische structuur bij het verwerken van onschadelijke en schadelijke signalen en speelt een cruciale rol bij pijn, jeuk en verschillende perifere zenuwaandoeningen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Hoewel er verschillende methoden zijn ontwikkeld om DRG-weefsel uit het ruggenmerg van de muis te ontleden14,15,16, blijft cryosectie van het DRG-weefsel een uitdaging omdat het DRG-weefsel vrij klein is en cryostat-secties van DRG-monsters de neiging hebben om in rollen te buigen, waardoor het moeilijk is om de cryostaatsecties op de juiste manier over te brengen op glasplaatjes. Een goede cryosectie van het DRG-weefsel is echter cruciaal voor immunohistochemische studies en de structuur van DRG-sensorische neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Bovendien, aangezien de resultaten van eencellige RNA-sequencing de opmerkelijke heterogeniteit van DRG-sensorische neuronen bij zowel mensen als muizen25 hebben onthuld, is een goede cryosectie van DRG-weefsel van cruciaal belang voor het onderzoeken van de functionele rol van verschillende DRG-cellen in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden.
Hoewel de weefselopruimingstechniek is toegepast om de 3D-reconstructie van de DRG26 te onderzoeken als een alternatieve techniek voor het cryosectieren van de DRG, is de weefselopruimingstechniek tijdrovend en arbeidsintensief. Ter vergelijking: cryosecties van de DRG zijn snel en relatief eenvoudig uit te voeren, en daarom blijft het een belangrijke techniek voor immunohistochemie en structuurstudies van de DRG en andere regio’s van het centrale zenuwstelsel. Het verkrijgen van hoogwaardige, intacte en vlakke cryostaatsecties op glasplaatjes blijft echter een uitdaging in neurowetenschappelijk onderzoek vanwege de kleine steekproefomvang van weefsels, zoals de DRG en bepaalde hersengebieden, en er is geen artikel dat het optimale protocol op dit moment beschrijft voor het cryosectieren van kleine weefselmonsters, zoals DRG’s van muizen.
Dit protocol biedt een eenvoudige, stapsgewijze techniek voor cryostaatsecties van de DRG van de muis om op betrouwbare wijze zoveel mogelijk DRG-secties van hoge kwaliteit op de objectglaasjes te verkrijgen voor volgende DRG-onderzoeken. Hoewel deze techniek specifiek is ontworpen voor het cryosectieren van DRG-monsters, kan deze mogelijk worden gebruikt voor het cryosectieren van verschillende andere weefsels met een kleine steekproefomvang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een eenvoudige stap-voor-stap procedure voor cryostaatsecties van de muis-DRG om op betrouwbare wijze DRG-secties van hoge kwaliteit op objectglaasjes te verkrijgen. Er zijn vier cruciale stappen in dit protocol. Eerst moeten het DRG-monster en het pincet droog zijn voordat het DRG-monster op de basis OCT wordt geplaatst. Elke vloeistof rond het DRG-monster zal er een ijsschil omheen vormen, waardoor DRG-secties zich scheiden van de LGO en omhoog buigen. Ten tweede, als het aluminium blok geen merkteke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
