Denne protokol beskriver, hvordan man bruger olierød O til at farve lipiddråber (LD’er), beregne størrelsen og antallet af LD’er i en fedtsyre-induceret fedthepatocytmodel og bruge BODIPY 493/503 til at observere processen med små LD’er, der smelter sammen til store LD’er ved levende cellebilleddannelse.
Lipiddråber (LD’er) er organeller, der spiller en vigtig rolle i lipidmetabolisme og neutral lipidopbevaring i celler. De er forbundet med en række metaboliske sygdomme, såsom fedme, fedtleversygdom og diabetes. I leverceller er størrelsen og antallet af LD’er tegn på fedtleversygdom. Desuden ledsages den oxidative stressreaktion, celleautofagi og apoptose ofte af ændringer i størrelser og antal LD’er. Som et resultat, dimensionerne og mængden af LD’er er grundlaget for den nuværende forskning vedrørende mekanismen for LD biogenese. Her beskriver vi i fedtsyreinducerede bovin leverceller, hvordan man bruger olierød O til at plette LD’er og undersøge størrelser og antal LD’er. Størrelsesfordelingen af LD’er analyseres statistisk. Processen med små LD’er, der smelter sammen til store LD’er, observeres også af et levende cellebilleddannelsessystem. Det nuværende arbejde giver mulighed for direkte at observere størrelsesændringstendensen for LD’er under forskellige fysiologiske forhold.
Akkumulering af lipiddråbe (LD) i hepatocytter er det typiske kendetegn ved ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), som kan udvikle sig til leverfibrose og hepatocellulært karcinom. Det har vist sig, at den tidligste manifestation af fedtleversygdom er steatose, karakteriseret ved LD-akkumulering i cytoplasmaet af hepatocytten1. Leversteatose er altid forbundet med et øget antal og/eller udvidet størrelse af LD’er2. LD’er menes at være genereret fra det endoplasmatiske retikulum (ER), der består af triglycerid (TG) som kernen, og er omgivet af proteiner og fosfolipider3. Som den subcellulære organel, der er ansvarlig for TG-opbevaring, udviser LD’er forskellige funktioner med hensyn til deres størrelse, antal, lipidsammensætning, proteiner og interaktion med andre organeller, som alle påvirker celleenergihomeostase4. TG-niveauet er positivt korreleret med størrelsen af LD’er, og et højere intracellulært TG-indhold kan danne større LD’er5. LD’er øges i størrelse gennem den lokale syntese af TG, lipidinkorporering i ER og fusion af flere LD’er6. Celler (adipocytter, hepatocytter osv.), Der indeholder store LD’er, har en særlig mekanisme til effektivt at øge lipidlagring ved LD-fusion. De dynamiske ændringer af LD’er afspejler cellens forskellige energimetabolismetilstande. Det er afgørende at udvikle metoder, der tillader observation og analyse af de forskellige hepatiske LD’er i raske og unormale celler.
De vigtigste ikke-fluorescerende farvestoffer til LD’er er Sudan Black B og olierød O. Sudan Black B pletter neutrale lipider, fosfolipider og steroider7. Olie rød O bruges hovedsageligt til farvning af LD’er af skeletmuskulatur, kardiomyocytter, levervæv, fedtceller osv.8., Og betragtes som et standardværktøj til kvantitativ påvisning af leversteatose hos mus og mennesker9. Den dynamiske ændring af LD’er udføres hovedsageligt ved fluorescensfarvning. Nilrød og BODIPY er begge almindeligt anvendte fluorescerende lipidfarvestoffer10,11. Sammenlignet med Nilrød har BODIPY stærkere vævspermeabilitet og binder bedre med LD’er12. BODIPY-mærkede LD’er kan bruges til farvning af levende celler og colokalisering med andre organeller13.
Forekomsten af fedtleversygdom er signifikant højere hos drøvtyggere end hos enmavede dyr14. I overgangsperioden oplever malkekøer en tilstand af negativ energibalance3. Store mængder ikke-esterificerede fedtsyrer (palmitinsyre, oliesyre, linolsyre osv.) syntetiseres til TG’er i bovin hepatocytter, hvilket fører til leverfunktionel abnormitet og i høj grad reducerer kvaliteten af mejeriprodukter og produktionseffektiviteten15. Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en protokol til analyse af størrelsen og antallet af LD’er samt at overvåge LD-fusionsdynamikken. Vi konstruerede en model af LD-dannelse ved at tilføje forskellige koncentrationer af linolsyre (LA) i hepatocytter16 og observerede ændringerne i størrelsen og antallet af LD’er under processen ved farvning af LD’er med olierød O. Derudover blev processen med hurtig fusion af LD’er også observeret ved farvning med BODIPY 493/503.
Afhængigt af de patologiske tilstande gennemgår hepatiske LD’er enorme ændringer i deres størrelse og antal. LD’er er bredt til stede i hepatocytceller og spiller en nøglerolle i leverens sundhed og sygdom18. Mængden og størrelsen af LD’er er grundlaget for den nuværende forskning om biogenese af LD’er19. Størrelsen og antallet af LD’er for celler og væv afspejler deres evne til at lagre og frigive energi. De dynamiske ændringer af LD’er opretholder stabiliteten …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet i fællesskab af National Natural Science Foundation of China (U1904116).
0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
cell counting chamber | equipment | ||
cell culture dish | Corning | 353002 | material |
cell sens software | Olympus IX73 | software | |
Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
Image view | image analysis sodtware | ||
linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
NIS-Elements | Nikon | software | |
oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
Pipette | Eppendorf | equipment | |
Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |