Evaluering af lipiddråbestørrelse og fusion i bovin leverceller

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger olierød O til at farve lipiddråber (LD’er), beregne størrelsen og antallet af LD’er i en fedtsyre-induceret fedthepatocytmodel og bruge BODIPY 493/503 til at observere processen med små LD’er, der smelter sammen til store LD’er ved levende cellebilleddannelse.

Abstract

Lipiddråber (LD’er) er organeller, der spiller en vigtig rolle i lipidmetabolisme og neutral lipidopbevaring i celler. De er forbundet med en række metaboliske sygdomme, såsom fedme, fedtleversygdom og diabetes. I leverceller er størrelsen og antallet af LD’er tegn på fedtleversygdom. Desuden ledsages den oxidative stressreaktion, celleautofagi og apoptose ofte af ændringer i størrelser og antal LD’er. Som et resultat, dimensionerne og mængden af LD’er er grundlaget for den nuværende forskning vedrørende mekanismen for LD biogenese. Her beskriver vi i fedtsyreinducerede bovin leverceller, hvordan man bruger olierød O til at plette LD’er og undersøge størrelser og antal LD’er. Størrelsesfordelingen af LD’er analyseres statistisk. Processen med små LD’er, der smelter sammen til store LD’er, observeres også af et levende cellebilleddannelsessystem. Det nuværende arbejde giver mulighed for direkte at observere størrelsesændringstendensen for LD’er under forskellige fysiologiske forhold.

Introduction

Akkumulering af lipiddråbe (LD) i hepatocytter er det typiske kendetegn ved ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), som kan udvikle sig til leverfibrose og hepatocellulært karcinom. Det har vist sig, at den tidligste manifestation af fedtleversygdom er steatose, karakteriseret ved LD-akkumulering i cytoplasmaet af hepatocytten¹. Leversteatose er altid forbundet med et øget antal og/eller udvidet størrelse af LD’er². LD’er menes at være genereret fra det endoplasmatiske retikulum (ER), der består af triglycerid (TG) som kernen, og er omgivet af proteiner og fosfolipider³. Som den subcellulære organel, der er ansvarlig for TG-opbevaring, udviser LD’er forskellige funktioner med hensyn til deres størrelse, antal, lipidsammensætning, proteiner og interaktion med andre organeller, som alle påvirker celleenergihomeostase⁴. TG-niveauet er positivt korreleret med størrelsen af LD’er, og et højere intracellulært TG-indhold kan danne større LD’er⁵. LD’er øges i størrelse gennem den lokale syntese af TG, lipidinkorporering i ER og fusion af flere LD’er⁶. Celler (adipocytter, hepatocytter osv.), Der indeholder store LD’er, har en særlig mekanisme til effektivt at øge lipidlagring ved LD-fusion. De dynamiske ændringer af LD’er afspejler cellens forskellige energimetabolismetilstande. Det er afgørende at udvikle metoder, der tillader observation og analyse af de forskellige hepatiske LD’er i raske og unormale celler.

De vigtigste ikke-fluorescerende farvestoffer til LD’er er Sudan Black B og olierød O. Sudan Black B pletter neutrale lipider, fosfolipider og steroider⁷. Olie rød O bruges hovedsageligt til farvning af LD’er af skeletmuskulatur, kardiomyocytter, levervæv, fedtceller osv.⁸., Og betragtes som et standardværktøj til kvantitativ påvisning af leversteatose hos mus og mennesker⁹. Den dynamiske ændring af LD’er udføres hovedsageligt ved fluorescensfarvning. Nilrød og BODIPY er begge almindeligt anvendte fluorescerende lipidfarvestoffer^10,11. Sammenlignet med Nilrød har BODIPY stærkere vævspermeabilitet og binder bedre med LD’er¹². BODIPY-mærkede LD’er kan bruges til farvning af levende celler og colokalisering med andre organeller¹³.

Forekomsten af fedtleversygdom er signifikant højere hos drøvtyggere end hos enmavede dyr¹⁴. I overgangsperioden oplever malkekøer en tilstand af negativ energibalance³. Store mængder ikke-esterificerede fedtsyrer (palmitinsyre, oliesyre, linolsyre osv.) syntetiseres til TG’er i bovin hepatocytter, hvilket fører til leverfunktionel abnormitet og i høj grad reducerer kvaliteten af mejeriprodukter og produktionseffektiviteten¹⁵. Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en protokol til analyse af størrelsen og antallet af LD’er samt at overvåge LD-fusionsdynamikken. Vi konstruerede en model af LD-dannelse ved at tilføje forskellige koncentrationer af linolsyre (LA) i hepatocytter¹⁶ og observerede ændringerne i størrelsen og antallet af LD’er under processen ved farvning af LD’er med olierød O. Derudover blev processen med hurtig fusion af LD’er også observeret ved farvning med BODIPY 493/503.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med de etiske standarder fra Animal Care Committee of Henan Agricultural University (Henan-provinsen, Kina). 1. Bovin hepatocytcellekultur Optø de primære hepatocytceller17 og centrifuger 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.BEMÆRK: De primære hepatocytceller blev dyrket og vedligeholdt efter en tidligere offentliggjort rapport17. …

Representative Results

Farvningen af celle LD’er er vist i figur 1. De røde prikker afspejler celle LD’er, og de blå prikker afspejler kernerne. Det kan ses, at størrelsen og antallet af LD’er i hvert billede er forskellige under behandlingen af LA. Med stigningen i LA-dosering viste den gennemsnitlige diameter og antallet af LD’er en signifikant stigende tendens afhængigt af LA-koncentrationen (figur 2). Som vist i figur 2A</strong…

Discussion

Afhængigt af de patologiske tilstande gennemgår hepatiske LD’er enorme ændringer i deres størrelse og antal. LD’er er bredt til stede i hepatocytceller og spiller en nøglerolle i leverens sundhed og sygdom¹⁸. Mængden og størrelsen af LD’er er grundlaget for den nuværende forskning om biogenese af LD’er¹⁹. Størrelsen og antallet af LD’er for celler og væv afspejler deres evne til at lagre og frigive energi. De dynamiske ændringer af LD’er opretholder stabiliteten …

Materials

0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent