ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価
Summary
本プロトコルでは、オイルレッドOを使用して脂肪滴(LD)を染色する方法、脂肪酸誘発脂肪肝細胞モデルでLDのサイズと数を計算する方法、およびBODIPY 493/503を使用して小さなLDが大きなLDに融合するプロセスを観察する方法について説明しますライブセルイメージングによる。
Abstract
脂肪滴(LD)は、細胞内の脂質代謝および中性脂質貯蔵において重要な役割を果たす細胞小器官です。それらは、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病などのさまざまな代謝性疾患に関連しています。肝細胞では、LDのサイズと数は脂肪肝疾患の兆候です。さらに、酸化ストレス反応、細胞オートファジー、およびアポトーシスは、LDのサイズと数の変化を伴うことがよくあります。その結果、LDの寸法と量は、LD生合成のメカニズムに関する現在の研究の基礎となっています。ここでは、脂肪酸誘導性ウシ肝細胞において、オイルレッドOを用いてLDを染色する方法と、LDのサイズと数を調べる方法について説明します。LDのサイズ分布を統計的に分析します。小さなLDが大きなLDに融合する過程は、生細胞イメージングシステムによっても観察されます。今回の研究は、異なる生理学的条件下でのLDのサイズ変化傾向を直接観察する方法を提供する。
Introduction
肝細胞における脂肪滴(LD)の蓄積は、肝線維症および肝細胞癌に進行する可能性のある非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の典型的な特徴です。脂肪肝疾患の最も初期の症状は脂肪症であり、肝細胞の細胞質におけるLD蓄積を特徴とすることが見出されている1。肝脂肪症は、常にLDの数の増加および/またはサイズの拡大に関連しています2。LDは、中性脂肪(TG)を核とした小胞体(ER)から生成されると考えられており、タンパク質やリン脂質に囲まれています3。TG貯蔵を担う細胞内オルガネラとして、LDは、そのサイズ、数、脂質組成、タンパク質、および他のオルガネラとの相互作用に関して異なる特徴を示し、これらはすべて細胞エネルギー恒常性に影響を与えます4。TGレベルはLDのサイズと正の相関があり、細胞内TG含有量が高いほど、より大きなLDを形成する可能性があります5。LDは、TGの局所合成、ERへの脂質の取り込み、および複数のLDの融合によってサイズが増加します6。大きなLDを含む細胞(脂肪細胞、肝細胞など)は、LD融合によって脂質貯蔵を効率的に増加させる特殊なメカニズムを持っています。LDの動的な変化は、細胞のさまざまなエネルギー代謝状態を反映しています。健常細胞と異常細胞における様々な肝LDの観察と解析を可能にする方法論を開発することが重要です。
LDの主な非蛍光色素はスーダンブラックBとオイルレッドOであり、スーダンブラックBは中性脂質、リン脂質、ステロイドを染色します7。オイルレッドOは、主に骨格筋、心筋細胞、肝臓組織、脂肪細胞などのLDの染色に使用され8、マウスおよびヒトの肝脂肪症を定量的に検出するための標準ツールと考えられています9。LDの動的変化は、主に蛍光染色によって行われる。ナイルレッドおよびBODIPYは、いずれも一般的に使用される蛍光脂質色素10、11である。ナイルレッドと比較して、BODIPYはより強い組織透過性を有し、LDs12とよりよく結合する。BODIPY標識LDは、生細胞の染色および他の細胞小器官との共局在に使用することができる13。
脂肪肝疾患の発生率は、反芻動物の方が単胃動物よりも有意に高い14。移行期間中、乳牛は負のエネルギー収支の状態を経験します3。ウシ肝細胞では、大量の非エステル化脂肪酸(パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸など)がTGに合成され、肝機能異常を引き起こし、乳製品の品質や生産効率を大幅に低下させます15。本研究は、LDのサイズと数を解析し、LD融合ダイナミクスを監視するためのプロトコルを提供することを目的としています。我々は、肝細胞16 に異なる濃度のリノール酸(LA)を添加してLD形成モデルを構築し、LDをオイルレッドOで染色することにより、プロセス中のLDのサイズと数の変化を観察しました。さらに、LDの急速な融合の過程は、BODIPY 493/503による染色によっても観察された。
Protocol
Representative Results
Discussion
病理学的状態に応じて、肝LDはその大きさおよび数において途方もない変化を受ける。LDは肝細胞細胞に広く存在し、肝臓の健康と病気に重要な役割を果たします18。LDの量とサイズは、LDの生合成に関する現在の研究の基礎です19。細胞および組織のLDのサイズと数は、エネルギーを貯蔵および放出する能力を反映しています。LDの動的変化は、脂質代謝活性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(U1904116)の共同支援を受けて行われました。
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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