Evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas
Summary
El presente protocolo describe cómo usar O rojo aceite para teñir gotas de lípidos (LD), calcular el tamaño y el número de LD en un modelo de hepatocitos grasos inducido por ácidos grasos, y usar BODIPY 493/503 para observar el proceso de pequeños LD que se fusionan en LD grandes mediante imágenes de células vivas.
Abstract
Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos que desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos y el almacenamiento de lípidos neutros en las células. Se asocian con una variedad de enfermedades metabólicas, como la obesidad, la enfermedad del hígado graso y la diabetes. En las células hepáticas, los tamaños y el número de LD son signos de enfermedad del hígado graso. Además, la reacción de estrés oxidativo, la autofagia celular y la apoptosis a menudo se acompañan de cambios en los tamaños y números de LDs. Como resultado, las dimensiones y la cantidad de LD son la base de la investigación actual sobre el mecanismo de la biogénesis de LD. Aquí, en células hepáticas bovinas inducidas por ácidos grasos, describimos cómo usar el aceite rojo O para teñir LD e investigar los tamaños y números de LDs. La distribución de tamaño de los LD se analiza estadísticamente. El proceso de fusión de LD pequeños en LD grandes también se observa mediante un sistema de imágenes de células vivas. El trabajo actual proporciona una manera de observar directamente la tendencia de cambio de tamaño de las LD bajo diferentes condiciones fisiológicas.
Introduction
La acumulación de gotitas de lípidos (LD) en los hepatocitos es la característica típica de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que puede progresar a fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Se ha encontrado que la manifestación más temprana de la enfermedad del hígado graso es la esteatosis, caracterizada por la acumulación de LD en el citoplasma del hepatocito1. La esteatosis hepática se asocia invariablemente con un aumento del número y/o tamaño expandido de LDs2. Se cree que los LD se generan a partir del retículo endoplásmico (RE), que consiste en triglicéridos (TG) como núcleo, y están rodeados de proteínas y fosfolípidos3. Como orgánulo subcelular responsable del almacenamiento de TG, los LD exhiben diferentes características en cuanto a su tamaño, número, composición lipídica, proteínas e interacción con otros orgánulos, todos los cuales afectan la homeostasis de la energía celular4. El nivel de TG se correlaciona positivamente con el tamaño de los LD, y un mayor contenido de TG intracelular podría formar LDs más grandes5. Los LD aumentan de tamaño a través de la síntesis local de TG, la incorporación de lípidos en el RE y la fusión de múltiples LD6. Las células (adipocitos, hepatocitos, etc.) que contienen LD grandes tienen un mecanismo especial para aumentar eficientemente el almacenamiento de lípidos por fusión de LD. Los cambios dinámicos de los LD reflejan los diferentes estados del metabolismo energético de la célula. Es crucial desarrollar metodologías que permitan la observación y el análisis de los diversos LD hepáticos en células sanas y anormales.
Los principales colorantes no fluorescentes para LD son Sudan Black B y oil red O. Sudan Black B tiñe lípidos neutros, fosfolípidos y esteroides7. El aceite rojo O se utiliza principalmente para teñir LDs de músculo esquelético, cardiomiocitos, tejido hepático, células adiposas, etc.8., y se considera una herramienta estándar para la detección cuantitativa de esteatosis hepática en ratones y humanos9. El cambio dinámico de LDs se lleva a cabo principalmente por teñido fluorescente. El rojo del Nilo y el BODIPY son colorantes lipídicos fluorescentes de uso común10,11. En comparación con el rojo del Nilo, BODIPY tiene una permeabilidad tisular más fuerte y se une mejor con LD12. Los LD marcados con BODIPY se pueden utilizar para teñir células vivas y colocalizar con otros orgánulos13.
La incidencia de hígado graso es significativamente mayor en animales rumiantes que en animales monogástricos14. Durante el período de transición, las vacas lecheras experimentan un estado de balance energético negativo3. Grandes cantidades de ácidos grasos no esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) se sintetizan en TG en hepatocitos bovinos, lo que conduce a una anomalía funcional hepática y reduce en gran medida la calidad de los productos lácteos y la eficiencia de la producción15. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para analizar el tamaño y el número de LD, así como para monitorear la dinámica de fusión LD. Construimos un modelo de formación de LD agregando diferentes concentraciones de ácido linoleico (LA) en hepatocitos16 y observamos los cambios en el tamaño y el número de LDs durante el proceso al teñir LDs con O rojo aceite. Además, el proceso de fusión rápida de LDs también se observó mediante tinción con BODIPY 493/503.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dependiendo de los estados patológicos, los LD hepáticos experimentan cambios tremendos en su tamaño y número. Las LD están ampliamente presentes en las células hepatocitos y desempeñan un papel clave en la salud y enfermedad hepática18. La cantidad y el tamaño de las LD son la base de la investigación actual sobre la biogénesis de las LD19. El tamaño y el número de LD para células y tejidos reflejan su capacidad para almacenar y liberar energía. Los cambios …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U1904116).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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