Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie man ölrotes O verwendet, um Lipidtröpfchen (LDs) zu färben, die Größe und Anzahl von LDs in einem Fettsäure-induzierten Fetthepatozytenmodell zu berechnen und BODIPY 493/503 zu verwenden, um den Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs durch Lebendzellbildgebung zu beobachten.
Abstract
Lipidtröpfchen (LDs) sind Organellen, die eine wichtige Rolle im Fettstoffwechsel und bei der neutralen Lipidspeicherung in Zellen spielen. Sie werden mit einer Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit, Fettleber und Diabetes in Verbindung gebracht. In Leberzellen sind Größe und Anzahl der LDs Anzeichen für eine Fettlebererkrankung. Darüber hinaus gehen die oxidative Stressreaktion, die Zellautophagie und die Apoptose oft mit Veränderungen in der Größe und Anzahl der LDs einher. Daher sind die Abmessungen und die Menge der LDs die Grundlage der aktuellen Forschung zum Mechanismus der LD-Biogenese. In dieser Arbeit beschreiben wir in fettsäureinduzierten bovinen Leberzellen, wie man ölrotes O zur Färbung von LDs und zur Untersuchung der Größe und Anzahl von LDs verwendet. Die Größenverteilung der LDs wird statistisch ausgewertet. Der Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs wird auch von einem Lebendzell-Bildgebungssystem beobachtet. Die vorliegende Arbeit bietet eine Möglichkeit, den Größenänderungstrend von LDs unter verschiedenen physiologischen Bedingungen direkt zu beobachten.
Introduction
Die Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in Hepatozyten ist das typische Merkmal der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die zu Leberfibrose und hepatozellulärem Karzinom fortschreiten kann. Es wurde festgestellt, dass die früheste Manifestation einer Fettlebererkrankung die Steatose ist, die durch eine LD-Akkumulation im Zytoplasma der Hepatozytengekennzeichnet ist 1. Eine Lebersteatose ist ausnahmslos mit einer erhöhten Anzahl und/oder einer erweiterten Größe von LDs2 verbunden. Es wird angenommen, dass LDs aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) gebildet werden, das aus Triglyceriden (TG) als Kern besteht, und von Proteinen und Phospholipiden umgeben sind3. Als subzelluläre Organelle, die für die TG-Speicherung verantwortlich ist, weisen LDs unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf Größe, Anzahl, Lipidzusammensetzung, Proteine und Interaktion mit anderen Organellen auf, die alle die Zellenergiehomöostase beeinflussen4. Der TG-Spiegel korreliert positiv mit der Größe der LDs, und ein höherer intrazellulärer TG-Gehalt könnte größere LDs bilden5. LDs nehmen durch die lokale Synthese von TG, den Einbau von Lipiden in das ER und die Fusion mehrerer LDs an Größezu 6. Zellen (Adipozyten, Hepatozyten usw.), die große LDs enthalten, verfügen über einen speziellen Mechanismus, um die Lipidspeicherung durch LD-Fusion effizient zu erhöhen. Die dynamischen Veränderungen der LDs spiegeln die unterschiedlichen Zustände des Energiestoffwechsels der Zelle wider. Es ist von entscheidender Bedeutung, Methoden zu entwickeln, die die Beobachtung und Analyse der verschiedenen Leber-LDs in gesunden und abnormen Zellen ermöglichen.
Die wichtigsten nicht-fluoreszierenden Farbstoffe für LDs sind Sudan Black B und Oil Red O. Sudan Black B färbt neutrale Lipide, Phospholipide und Steroide7. Ölrot O wird hauptsächlich zur Färbung von LDs von Skelettmuskeln, Kardiomyozyten, Lebergewebe, Fettzellen usw.verwendet 8. und gilt als Standardwerkzeug für den quantitativen Nachweis von Lebersteatose bei Mäusen und Menschen9. Die dynamische Veränderung von LDs erfolgt hauptsächlich durch Fluoreszenzfärbung. Nilrot und BODIPY sind beides häufig verwendete fluoreszierende Lipidfarbstoffe10,11. Im Vergleich zu Nilrot hat BODIPY eine stärkere Gewebedurchlässigkeit und bindet besser an LDs12. BODIPY-markierte LDs können für die Färbung lebender Zellen und die Kolokalisation mit anderen Organellen verwendet werden13.
Die Inzidenz einer Fettlebererkrankung ist bei Wiederkäuern signifikant höher als bei monogastrischen Tieren14. Während der Übergangszeit erleben Milchkühe einen Zustand negativer Energiebilanz3. In Rinderhepatozyten werden große Mengen an nicht veresterten Fettsäuren (Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure usw.) zu TGs synthetisiert, was zu Funktionsstörungen der Leber führt und die Qualität der Milchprodukte und die Produktionseffizienz erheblich verringert15. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Protokoll zur Analyse der Größe und Anzahl der LDs sowie zur Überwachung der LD-Fusionsdynamik bereitzustellen. Wir konstruierten ein Modell der LD-Bildung durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von Linolsäure (LA) in Hepatozyten16 und beobachteten die Veränderungen in der Größe und der Anzahl der LDs während des Prozesses, indem wir LDs mit ölrotem O färbten. Darüber hinaus wurde der Prozess der schnellen Fusion von LDs auch durch Färbung mit BODIPY 493/503 beobachtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abhängig von den pathologischen Zuständen verändern sich die hepatischen LDs enorm in ihrer Größe und Anzahl. LDs sind in Hepatozytenzellen weit verbreitet und spielen eine Schlüsselrolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Leber18. Die Menge und Größe der LDs sind die Grundlage der aktuellen Forschung zur Biogenese der LDs19. Die Größe und Anzahl der LDs für Zellen und Gewebe spiegelt ihre Fähigkeit wider, Energie zu speichern und freizusetzen. Die dynamische…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (U1904116) unterstützt.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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