본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.
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방법 논문
Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)
이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안 생체 시스템 및 프로세스에 대한 비침습적, 실시간 및 종단 정보를 제공하는 생체 내 망막 영상이 안과 질환의 신경 손상에 대한 객관적인 평가를 얻기 위해 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 특히 동물 연구에서 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 이 연구에서는 생쥐 망막의 생체 외 공초점 이미지를 생체 내 이미지와 정렬하는 방법을 시연했습니다. 가시광선 광간섭 단층 촬영 섬유촬영(vis-OCTF)이라는 새로운 임상 준비 이미징 기술을 적용하여 생쥐 망막의 생체 내 이미지를 획득했습니다. 그런 다음 "골드 스탠다드"와 동일한 망막의 컨포칼 이미징을 수행하여 in vivo vis-OCTF 이미지를 검증했습니다. 이 연구는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 생체 내 신경 손상에 대한 민감하고 객관적인 평가를 위한 기반을 마련합니다.
서론
망막 신경절 세포(RGC)는 시각 정보 처리에 중요한 역할을 하며, 내부 망상층(IPL)의 수지상 나무를 통해 시냅스 입력을 받고 망막 신경 섬유층(RNFL)의 축삭을 통해 뇌로 정보를 전달합니다 1,2,3,4. 녹내장과 같은 질병이 있는 상태에서, 초기 망막 신경절 변성은 환자와 설치류 모델 모두에서 RNFL, 신경절 세포층(GCL), IPL 및 시신경에 미묘한 변화를 초래할 수 있다 5,6,7,8,9. 따라서 망막 신경절 세포의 이러한 형태학적 변화를 조기에 발견하는 것은 망막 신경절 세포와 시력 상실을 예방하기 위한 적시 개입에 필수적입니다.
당사는 최근 망막 신경절 손상의 생....
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프로토콜
모든 동물 시술은 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(NIH)의 동물 사용 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. In vivo vis-OCT 이미징
- vis-OCT 시스템
- 480nm에서 650nm 사이의 가시광선 조명을 제공하는 초연속체 광원을 사용하는 작은 동물 vis-OCT 시스템을 사용하여 쥐의 눈을 이미지화합니다. 각막에 입사되는 전력이 1mW인지 확인하고 25kHz의 A-라인 속도와 A-라인당 39.3μs의 통합 시간을 사용합니다.
- 분광계의 스펙트럼 검출 범위가 508nm에서 613nm 사이인지 확인하여 망막에서 1.3μm의 축 분해능을 제공합니다. 총 이미징 부피는 약 700μm(x) x 700μm(y) x 1,500μm(z)입니다. 측면 해상도는 시야 중심에서 4.5μm, 중심에서 350μm에서 8.7μm 사이입니다(11,13).
- ....
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결과
복합 vis-OCT 파이버그램은 망막 신경절 축삭돌기에 대해 Tuj-1로 면역염색된 평판 장착 망막의 해당 컨포칼 이미지와 비교됩니다(그림 1D, 상단 패널). vis-OCTF로 이미징된 축삭 다발은 공초점 이미지에서 Tu-j1 표지된 축삭 다발과 일치시킬 수 있습니다. 혈관은 일반적으로 섬유그램 이미지에서 주변 축삭 다발과 비교하여 구별 가능한 분지 구조를 나타내며, 이는 공초점 이미지에서 ICAM-2 표지 혈관과 일치할 수 있습니다(그림 1D, 하단 패널).
체외 공초점 현미경과 in vivo vis-OCT를 나란히 비교한 결과, 동일한 망막 신경절 축삭 다발 네트워크와 주변 망막 혈관 구조가 밝혀졌습니다. 공초점 이미지는 특히 주변 영역에서 생체 내 이미지와 완벽하게 일치하지 않을 수 있습니다. 망막이 슬라이드에 평평하게.......
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토론
이 프로토콜에는 주의가 필요한 두 단계가 있습니다. 첫째, 동물이 깊은 마취 상태인지 확인하고 vis-OCT 영상 전에 눈이 완전히 확장되었는지 확인해야 합니다. 마우스가 적절하게 마취되지 않으면 빠른 호흡으로 인해 얼굴 이미지의 불안정한 움직임이 발생할 수 있으며, 이는 파이버그램의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 불충분한 팽창은 홍채가 빛을 차단하여 망막에 도달하는 것을 방해할 수 있기 때문에 이미지 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 왼쪽 또는 오른쪽 눈과 눈의 측두엽을 관류 후 쥐의 안와에서 안구를 제거하기 전에 표시하는 것이 중요합니다. 편평하게 장착된 망막은 표층에서 RNFL과 함께 위쪽을 향하고 있기 때문에 측두면을 표시하면 편평하게 장착된 망막의 올바른 방향이 가능합니다.
장점 중 하나는 전안이 광학 이미징을 위해 깨끗하다면 망막 허혈 및 당뇨병성 망막병증과 같은 안과 질환의 다양한 마우스 모델에 프로토콜을 적용할 수 .......
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공개 사항
Chang, S., 없음; Xu, W., 없음; 팬, W., 없음; McDaniel, J.A., 없음; D.A. 밀러, 없음; M. 그라노니코, 없음; M. 리우, 없음; X. 리우, 없음; H.F. Zhang 은 Opticent Health에 재정적 이해관계를 가지고 있으며, Opticent Health는 이 작업을 지원하지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 녹내장 연구 재단 Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 및 Knights Templar Eye Foundation의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antidies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA)Santz | Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 방울 | |
| 소 혈청 알부민 분말 | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| 당나귀 안티 마우스 Alexa Fluor 488 염료 | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| 당나귀 안티 랫 Alexa Fluor 594 염료 | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (펜토바르비탈 나트륨(390 mg/mL) 및 페니토인 나트륨(50 mg/mL)의 혼합물) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| 케타민 | 코베트루스, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| 마우스 anti-Tuj1 | 버지니아 대학교 Anthony J. Spano의 선물 | 1:200 | |
| 써모 피셔 사이언티픽, Cat# J62036. K3 | 1:10 | ||
| 쥐 anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| 트로피카마이드 드롭 | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (시약 등급) | VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield 장착 매체 | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
참고문헌
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal gangli....
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재인쇄 및 허가
