Ett arbetsflöde för att kvantitativt bestämma åldersrelaterade makuladegenerationslesionsspecifika variationer i fundus autofluorescens

Summary

Denna forskning beskriver ett arbetsflöde för att bestämma och jämföra autofluorescensnivåer från enskilda regioner av intresse (t.ex. drusen och subretinala drusenoidavlagringar vid åldersrelaterad makuladegeneration [AMD]) samtidigt som man tar hänsyn till varierande autofluorescensnivåer i hela fundus.

Abstract

Ögonbottenautofluorescens (FAF) möjliggör icke-invasiv kartläggning av inneboende fluoroforer i ögonbotten, särskilt retinalt pigmentepitel (RPE), som nu kan kvantifieras med tillkomsten av konfokal skanningslaseroftalmoskopi baserad kvantitativ autofluorescens (QAF). QAF har visat sig vara generellt nedsatt vid den bakre polen vid åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Förhållandet mellan QAF och olika AMD-lesioner (drusen, subretinala drusenoidavlagringar) är fortfarande oklart.

I det här dokumentet beskrivs ett arbetsflöde för att fastställa lesionsspecifik QAF vid AMD. En multimodal in vivo-avbildningsmetod används, inklusive men inte begränsat till spektraldomänoptisk koherenstomografi (SD-OCT), makulavolymskanning och QAF. Med hjälp av anpassade FIJI-plugin-program justeras motsvarande QAF-bild med den nära infraröda bilden från SD-OCT-skanningen (karakteristiska landmärken, dvs. kärlförgreningar). Foveolan och kanten av synnervshuvudet markeras i OCT-bilderna (och överförs till den registrerade QAF-bilden) för exakt positionering av analysgallren.

AMD-specifika lesioner kan sedan markeras på enskilda OCT BScans eller själva QAF-bilden. Normativa QAF-kartor skapas för att ta hänsyn till det varierande medelvärdet och standardavvikelsen för QAF-värden i hela fundus (QAF-bilder från en representativ AMD-grupp beräknades i genomsnitt för att skapa normativa standard retinala QAF AMD-kartor). Plugin-programmen registrerar X- och Y-koordinater, z-poäng (ett numeriskt mått som beskriver QAF-värdet i förhållande till medelvärdet av AF-kartor i termer av standardavvikelse från medelvärdet), medelintensitetsvärde, standardavvikelse och antal markerade pixlar. Verktygen bestämmer också z-poäng från gränszonen för markerade lesioner. Detta arbetsflöde och analysverktygen kommer att förbättra förståelsen för patofysiologin och tolkningen av kliniska AF-bilder vid AMD.

Introduction

Fundus autofluorescens (FAF) avbildning ger en icke-invasiv kartläggning av naturligt och patologiskt förekommande fluoroforer i ögonfundus¹. Den vanligaste blå (488 nm excitation) autofluorescensen (AF) exciterar lipofuscin- och melanolipofuscinkorn i retinalt pigmentepitel (RPE)^2,3,4. Fördelningen och ökningen/minskningen av granulat spelar en central roll vid normalt åldrande och olika näthinnesjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)⁵.

En vidareutveckling av FAF, kvantitativ fundus autofluorescens (QAF), möjliggör nu noggrann bestämning av topografiskt upplösta retinala AF-intensiteter ^4,6. Genom att integrera en referens i FAF-bildenhetens optiska väg kan AF-intensiteter jämföras mellan enheter, tidpunkter och motiv. Denna teknik har resulterat i ett paradigmskifte när det gäller en förmodad patogenetisk faktor vid AMD, som länge spekulerades bero på överdriven ansamling av lipofuscin i RPE-celler7. Histologisk och klinisk kvantifiering av AF har dock visat en minskning av AF vid AMD (på grund av omfördelning och förlust av autofluorescerande lipofuscin och melanolipofuscingranuler), istället för den föreslagna ökningen av AF ^8,9,10.

Övervakning av förmaksflimmer har kliniska implikationer. Von der Emde et al. och andra har visat att AF inte bara minskar utan också ytterligare minskar under AMD-förloppet i högrisk, intermediära AMD-ögon ^8,9. Dessutom tyder histologiska studier på att de flesta AMD-påverkade RPE-celler uppvisar ett karakteristiskt beteende med granulaggregering och extrudering före RPE-cellförlust via subduktion, sloughing, migration eller atrofi^13,14,15,16. Detta indikerar ytterligare att AF-förlust kan vara en utlösande faktor eller en surrogatsignal om förestående sjukdomsprogression.

QAF-studier har hittills endast utvärderat AF globalt vid den bakre polen med hjälp av prefabricerade polära koordinatsystem (t.ex. QAF8/Delori Grid)¹⁷. Om du använder prefabricerade raster för att mäta AF får du flera AF-värden på förutbestämda områden per öga på ett motiv. Att undersöka AF-värden på detta sätt kan missa lokala förändringar i områden med patologiskt förändrat AF, till exempel i AMD ovanpå eller nära drusen eller subretinala drusenoidavlagringar (SDD). Drusen, och i högre grad SDD, är förknippade med en hög risk att utveckla sen AMD och synförlust. Drusen i synnerhet har en typisk cykel av ökande i storlek under många år och kan försämras snabbt före atrofi. Det är tänkbart att till exempel global AF minskar vid AMD, men ökar eller till och med minskar ytterligare i och runt dessa specifika sjukdomsrelaterade fokala lesioner.

Olika lokala AF-mönster kan också ha prognostisk relevans för sjukdomsprogression. Till exempel kan autofluorescensnivåer användas för att bedöma om drusen ökar i storlek eller redan är i regression till atrofi. Det har redan visats att förändrade förmaksflimmermönster vid geografisk atrofi till stor del påverkar atrofiprogressionen över tid¹⁸. Dessutom kan lokala autofluorescensmönster avslöja ytterligare detaljer om RPE:s hälsa. Ofta visar den optiska koherenstomografin (OCT) hyperreflektans in i choriocapillaris, även om RPE-skiktet verkar intakt. Ett multimodalt tillvägagångssätt som kombinerar lokala QAF-värden och OCT kan hjälpa till att differentiera lesioner med hög risk för RPE-störning och överhängande atrofi.

En anledning till att rumsligt upplösta analyser i studier inte har utförts är att den vanligaste tillverkarens programvara inte tillhandahåller ett verktyg för dessa typer av analyser. AF-egenskaper hos olika lesioner beroende på AMD-sjukdomsstadiet skulle ytterligare kunna förklara patogenesen av AMD. Därför skulle ett verktyg för att mäta regionala, lesionsspecifika AF vara önskvärt. För att exakt jämföra lesioner som finns i hela näthinnan behöver arbetsflödet ett sätt att ta hänsyn till olika grader av AF i den mänskliga fundus¹⁹. Mest centralt är AF karakteristiskt lägre på grund av skuggningseffekterna av makulapigment och olika granulatantal^20,21.

AF når sin topp vid ~9° (avstånd till fovea i alla riktningar) och minskar i större utsträckning perifert⁴. Därför, om man skulle jämföra absoluta värden för AF-nivåer från mjuka drusen (belägna vid fovea och parafovea i områden med låga AF) och SDD (belägna paracentralt i områden med hög AF), skulle resultaten inte vara jämförbara²². Inspirerad av arbetet av Pfau et al. och konceptet med känslighetsförlust (korrigering av känslighet mätt i AMD för synkullen [minskande näthinnekänslighet med avstånd till fovea] hos friska kontroller) för funduskontrollerad perimetri, jämförs AF med standardiserade AF-värden i hela gula fläcken^23,24. Resultaten rapporteras som z-poäng (numeriskt mått på ett värde för en region av intresse i förhållande till medelvärdet).

Syftet med denna studie är att utvärdera användningen av ett nytt verktyg för att mäta lokala QAF-nivåer i olika typer av lesioner hos patienter med AMD. Detta verktyg är utformat för att mäta autofluorescensnivåer av lesioner som identifierats vid OCT-skanningar. Detta möjliggör bedömning av lokala autofluorescensnivåer i lesioner, såsom mjuk drusen eller SDD, och gör det möjligt att spåra AF-förändringar från lesioner över tid. Den potentiella nyttan av detta verktyg är att möjliggöra en ny strukturell biomarkör som uppskattar hälsan hos RPE och kan ha prognostiskt värde för de undersökta lesionerna.

Protocol

Studien genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av den etiska kommittén vid universitetet i Bonn (protokollkod 305/21). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner som deltog i studien. Vi krävde att alla deltagare i videon skulle underteckna ett formulär som gav oss tillåtelse att använda deras bild och personliga information för att skapa en onlinevideo. 1. Kvantitativ autofluorescens (QAF) bildinsamling För korrekt bildinsamling med QAF-enheten, se till att deltagaren sitter bekvämt framför enheten. Låt deltagaren trycka hakan och pannan mot hak- och nackstödet. Justera hakstödets höjd tills ögonlocksvinkeln på sidan är i samma höjd som den röda markeringen. Se till att bilden är fokuserad i det kortvågiga infraröda läget genom att vrida hjulet på inspelningsenheten tills de små kärlen är i fokus. Zooma in på ögat genom att flytta kameran framåt tills bildens hörn är jämnt upplysta. Som en tumregel bör du justera fokus till den sfäriska motsvarigheten. Minska fokus före QAF-avbildning med en eller två dioptrier, eftersom blå QAF använder en kortare våglängd, och byt QAF-enhetens modus från nära infrarött till QAF-läge. Justera och skala upp belysningen och finjustera bildens fokus tills de små kärlen närmast fovea är i fokus och bilden är starkt upplyst utan röda prickar (indikerar överbelysning). Blek fotopigmentet genom att vänta minst 30 s i QAF-läget före bildtagning för att tillåta den fortsatta blåljusexcitationen att bleka fotoreceptorpigmentet i fältet view av kamerainställningarna. För att ta bilder, tryck på bildtagning på bildenhetens pekplatta; se till att ta mer än en QAF-bild i händelse av blinkande eller plötsliga ögonrörelser under förvärvet.OBS: Arbetsflödet kräver också spektraldomänoptisk koherenstomografi (SD-OCT) bilder. OCT-bildtagning förklaras på annat håll, eftersom det används i stor utsträckning i klinisk praxis25. 2. Export av bilder För den här analyspipelinen kontrollerar du att QAF- och OCT-bilderna är i XML-filformatet (Extensible Markup Language). I HEYEX-visaren högerklickar du på en önskad QAF/OCT-bild och väljer Exportera | som XML från rullgardinsmenyn. 3. Plugin-program med öppen källkod för QAF-analys – installera pipelinen OBS: Den presenterade QAF-programvaran är ett plugin-program med öppen källkod som heter “Spectralis pipeline” skapat för programvaran med öppen källkod ImageJ (FIJI-expansion)26. Om du vill komma åt plugin-programmet öppnar du FIJI, väljer Hjälp och sedan Uppdatera i listrutan och klickar sedan på Hantera uppdateringswebbplatser för att lägga till Creative Computation Update Site “https://sites.imagej.net/CreativeComputation/” på de befintliga uppdateringswebbplatserna. Ladda ner plugin-programmen och starta sedan om FIJI. Nu är Spectralis Pipeline installerad. De olika Spectralis plug-ins finns under rullgardinsmenyn Plugins | Spectralis eller Plugins | SpectralisBatch. 4. Inställning – datalagring OBS: För att möjliggöra ett sömlöst arbetsflöde rekommenderar vi att du ställer in mappstrukturen enligt följande. Skapa först en mapp för varje studieämne. Oculus dexter (OD) och oculus sinister (OS) hänvisar till höger respektive vänster öga, och dessa förkortningar används i hela det här arbetsflödet. För varje undersökt öga hos varje försöksperson, skapa en mapp för en OCT, som heter OD_OCT respektive OS_OCT. Låt Spectralis-pipelinen automatiskt lagra sina utdata från plugin-programmet “Mark_BScans_OCT” som tabbavgränsade värden i dessa mappar. För QAF-avbildningarna skapar du två mappar med namnen OD_QAF och OS_QAF. Skapa ytterligare mappar om andra multimodala avbildningsmodaliteter används. Kontrollera att den resulterande mappstrukturen liknar den struktur som anges nedan:CASE_IDOD_OCTOD_QAFOD_other_imaging_modalityOS_OCTOS_QAFOS_other_imaging_modality 5. Konvertering av QAF XML-filen till en QAF-bild (plugin-program som används: QAF_xml_reader) Spectralis QAF XML Export files lagras i röd-grön-blå (RGB) format, begränsat till en skala från 0 till 255 (som representerar uppmätta AF-värden) och inkluderar “standard” och “svart” kalibreringsområden. Plugin-programmet “QAF_xml_reader” skapar en QAF-avbildning. För detta, öppna rullgardinsmenyn för plugin-program , välj Spectralis | QAF_XML_Reader och kassera öppningsskärmen. Ett nytt fönster visas med uppmaningen Välj en katalog som innehåller en Spectralis XML QAF Export:. Markera katalogen och klicka på Välj. Ange referenskalibreringsfaktorn (RCF) för QAF-enheten (ingår i bildinformationen på QAF-bilden) och patientens ålder vid tidpunkten då bilden togs. Nästa fönster heter QAF-parametrar. Om patienten är pseudofakisk vid bildtagningen, välj 20 år istället (detta har effekten att ingen ålderskorrigering tillämpas). När du har klickat på OK, när ett popup-fönster med etiketten Mappa till 8 bitar visas, anger du det lägsta QAF-värdet (qafMin) och det högsta QAF-värdet (qafMax) för en färgkodad QAF-bild. Om qafMin och qafMax är okända, använd standardinställningarna, klicka på OK och observera originalbilden märkt Raw QAF Data som visas, samt 32-bitars QAF och 8-bitars färgkodad QAF-bild.OBS: Den färgkodade QAF-bilden används endast i illustrativt syfte; 32-bitars QAF-avbildningen med faktiska QAF-värden används för ytterligare analys. 6. Registrera QAF-bilder med OCT-bilden (plugin-program som används: Register_OCT_2) OBS: Detta steg behövs för att exakt justera OCT-bilden med QAF-bilden, så att lesioner i QAF-bilderna och OCT BScans är i linje. Gå till plugin-programmet via rullgardinsmenyn Plugins | Spectralis, eller skapa en snabbtangent för att komma åt de olika plugin-program som används. För att uppnå detta, välj Register_OCT_2 under Plugins | Genvägar | Lägg till genväg och välj önskad snabbtangent. När du har öppnat plugin-programmet klickar du på OK i det första fönstret som visas. Därefter visas ett fönster som innehåller prompten: Välj en katalog som innehåller Spectralis OCT XML-exporten: i huvudfönstret för ImageJ. Välj mappen som innehåller Spectralis OCT XML Export och klicka på Öppna.OBS: OCT kommer nu att laddas, vilket beroende på processorkraften hos den dator som används kan ta upp till 2 minuter. Vänta sedan på att ett fönster som innehåller uppmaningen Spara registrerade bilder till: ska dyka upp. Välj den katalog där EnFaceStack (justerad bildfil) ska lagras och klicka på Öppna. Vänta tills ett popup-fönster innehåller uppmaningen Välj en bild att lägga till i EnFaceStack: för att visas, välj 32-bitars QAF-bilden för att justera bilden med SD-OCT och klicka på Öppna. Om alla nödvändiga bilder i denna EnFaceStack ingår väljer du Avbryt. När nästa fönster ber användaren att välja en etikett för EnFaceStack väljer du den färdiga QAF-etiketten . Alternativt kan du ange önskat namn på modaliteten i rutan Annat. Välj OK för att registrera avbildningen.Ta inte med mellanslag eller andra skiljetecken i fältet Övrigt . Observera de tre fönstren som dyker upp. Den första är märkt Localizer och visar SD-OCT som en bild med vänster öga . Det andra fönstret heter QAF eller någon av de andra modaliteterna som valdes tidigare som det ursprungliga vänstra (OS) eller högra (OD) ögat. Det sista fönstret heter Landmärken, som ber om att välja ett till tre landmärken i varje bild. Justera de två bilderna genom att välja ett till tre landmärken per bild-kärlförgreningar eller andra egenskaper som finns på båda modaliteterna. Zooma in (använd tangentbordstecknet ” +” för att zooma in och ” -” för att zooma ut) innan du väljer landmärket. Se till att de valda landmärkena sprids ut både vertikalt och horisontellt i bilden. När alla landmärken har kommenterats väljer du OK på fliken Landmärken och Avbryt vid nästa uppmaning. När ett fönster med frågan Vill du se resultatet visas väljer du Ja för att kontrollera om bilden har justerats korrekt. Gör detta genom att zooma in på ett litet kärl och placera markören bredvid det, och sedan rulla uppåt eller nedåt för att kontrollera hur mycket kärlet rör sig i förhållande till markören. Om justeringen inte är exakt tar du bort “.tiff”-filen i OD_QAF-katalogen och startar om processen från början av steg 2.OBS: Eftersom markeringarna på Mark_BScans_OCT måste vara exakta måste justeringen mellan SD-OCT- och QAF-bilden också vara mycket exakt. Pixelperfekt justering kan uppnås på de flesta bilder, även om justeringen i vissa fall är begränsad till en noggrannhet på tre eller fyra pixlar. 7. Skapa en genomsnittlig QAF-bild för jämförelse (plugin-program som används: StandardRetina/BatchStandardRetina) OBS: QAF-värden är starkt beroende av näthinnans läge (t.ex. central skuggning orsakad av makulapigment). Därför bör QAF-värdena för drusen jämföras med standard-QAF-värdena för samma region. Som en förutsättning för analys skapar StandardRetina en enface-karta över genomsnittliga QAF-bilder (till exempel från en åldersmatchad kontrollkohort). Den resulterande ansiktskartan visar en pixel-för-pixel-karta över ett genomsnittligt QAF-värde för den centrala näthinnan. Det finns två sätt att skapa standardnäthinnor i Spectralis-pipelinen: det första, AddToStandardRetina_OCT, tillåter ett nytt fall i taget till enface-kartan, medan det andra, BatchStandardRetina, lägger till flera fall samtidigt.Om du vill lägga till en bild i taget väljer du Plugins | Spektral | AddToStandardRetina_OCT och stäng öppningsskärmen. När ett fönster dyker upp som visar texten Välj en katalog som innehåller en Spectralis OCT XML-export, välj mappen och klicka på Välj för att öppna BScan. När ett nytt fönster visas med uppmaningen Välj en katalog som innehåller registrerade EnFace-bilder: väljer du lämplig mapp och klickar på Välj. Observera de tre fönstren som dyker upp, ett märkt EnFaceStack som visar staplade bilder från mappen som valdes i det andra steget, det andra märkt Bscan Stack som visar OCT BScan och ett tredje fönster som visas i mitten märkt Välj modalitet. Välj en modalitet från EnFaceStack. Välj en modalitet och observera det nya fönstret som dyker upp med prompten Välj en katalog som innehåller StandardRetina. Om det inte redan finns en katalog som innehåller en StandardRetina väljer du en tom mapp för att skapa en ny StandardRetina. Granska den nya StandardRetina, rulla uppåt och nedåt och flytta markören för att visa medelvärdet och standardavvikelsen för den specifika platsen. Klicka på knappen Acceptera? För att antingen lägga till det senaste fotot i StandardRetina eller ta bort det. Om du vill lägga till flera bilder samtidigt använder du Batch_QAF_StandardRetina. Förbered först en “manifest.txt” -fil i samma mapp som ärende-ID: erna och se till att den visar den relativa sökvägen från platsen för .txt-filen till OCT och EnFaceStack. Separera de två med ett tabbutrymme och se till att det inte finns något ytterligare blanksteg framför och bakom namnen. Filen bör likna den här konfigurationen:pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAFpathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF Skapa filen i kalkylprogram och spara den som en txt-fil. Se till att alla sökvägar innehåller segmentet (teckenbokstäver) QAF för att manifestfilen ska fungera korrekt. Plugin-programmen finns under rullgardinsmenyn Plugins | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina. Stäng öppningsskärmen och vänta tills ett nytt fönster öppnas som visar uppmaningen Välj den initiala Standard Retina. Välj antingen en mapp med en befintlig StandardRetina eller välj en tom mapp för att skapa en ny StandardRetina. Leta efter en uppmaning märkt Välj modalitet som ska visas; Standardvärdet är QAF. Kontrollera att filnamnet för respektive modalitet exakt matchar filnamnet för en sektor i varje EnFaceStack som namnges i manifestfilen. När ett fönster öppnas där användaren uppmanas att välja en manifestfil (som beskrivits ovan) klickar du sedan på Avbryt om ingen annan manifestfil ska läggas till i den här StandardRetina eller väljer en annan manifestfil. Undersök den nya StandardRetina i ett nytt fönster med etiketten Acceptera? och bestäm om du vill lägga till den senaste batchen i StandardRetina eller ta bort den senaste batchen.OBS: Processen att kombinera alla QAF:er till en StandardRetina kan ta ett tag. 8. Kommentera regioner av intresse för analys (plugin-program som används: Mark_BScans_OCT) För att markera lesioner (t.ex. drusen), öppna Plugins | Spektral | Mark_BScans_OCT och avfärda öppningsprompten. Leta efter ett nytt fönster med etiketten Välj en katalog som innehåller en Spectralis OCT XML-export som ska visas. Välj den mapp som har önskat OKT och klicka på OK. Efter att FIJI har laddat OCT, observera det nya fönstret med etiketten Välj en katalog som innehåller registrerade ansiktsbilder som ska visas. Välj katalogen som innehåller EnFaceStack och klicka på Välj. Tre nya fönster visas nu, ett märkt EnFaceStack, ett märkt BscanStack och ett namngivet User Parameters.Fönstret Användarparametrar uppmanar användaren att ange följande parametrar: Ärende-ID, som då visas i namnet på utdata-csv-filen, bandbredd i mm, ansiktslinjens bredd, BScan-linjens bredd och regionmaskens opacitet.Parametern bandbredd i mm bestämmer bredden på varje isoskrov i millimeter ( mm ). Använd Enface-linjebredd för att ändra linjebredden för markerade lesioner i fönstret med etiketten EnFaceStack. BScan-linjebredden bestämmer linjebredden i fönstret Bscan Stack. Observera att om du ställer in den här parametern på 1 är den bästa linjebreddsinställningen i de flesta fall. Välj mellan en En ansiktsmask eller en avståndskarta som visas i ett separat fönster för att bestämma om inre band ska färgas in. Klicka sedan på klar i fönstret Markera i BScan i plugin-programmet. När du sedan uppmanas att välja en befintlig StandardRetina väljer du mappen som innehåller StandardRetina och klickar på Välj. Observera att om en StandardRetina väljs kommer utdata Mark_BScans_OCT att välja läget z-poäng (för ett uppmätt QAF-värde jämfört med StandardRetina). Om det råa QAF-värdet är att föredra klickar du på Avbryt och väntar på ett nytt fönster med etiketten Meddelande som varnar för att resultatet kommer att vara råvärden, inte z-poäng. Leta efter ett nytt fönster som dyker upp och frågar Välj en katalog som innehåller det sparade tillståndet med sparade data. Om det finns en sparfil klickar du på katalogen som innehåller skivorna | Välj. Om förloppet inte ska sparas väljer du Avbryt. Leta efter ett nytt fönster märkt Markera i BScan och välj spara, ignorera, klar och markera i en rullgardinsmeny.Markera: Börja kommentera de intressanta områdena i BScan, med liknande kommandon som i plugin-programmet “Register_OCT_2” som förklaras ovan. För att markera ett område, välj börja genom att högerklicka och dra muspekaren till slutet av lesionen, se till att markeringen är markerad i fönstret Markera i B-SScan och klicka på OK. Området av intresse är nu markerat i denna BScan. Bortse från: Välj Ignorera i fönstret Markera i BScan och klicka på OK för att ignorera markeringen. Spara: Välj spara i fönstret Markera i BScan och klicka på OK för att få ett nytt fönster att visas, som innehåller uppmaningen att välja en katalog att spara tillstånd för. Välj en redan befintlig mapp eller skapa en ny. Öppna redan befintliga filer genom att starta “Mark_BScans_OCT” och välj den katalog som innehåller sparläget när fönstret Välj en katalog som innehåller det sparade tillståndet visas.OBS: Flera sparlägen kan inte lagras i en katalog; Det är inte lätt att byta tillstånd från en plats till en annan (t.ex. TYSKA till USA). Färdig: Välj klar i fönstret Markera i BScan och klicka på OK för att få ett nytt fönster med etiketten välj modalitet att visas. När en uppmaning med etiketten “ta med rätt modalitet ovanpå enface-stacken visas” tar du med modaliteten QAF överst, som justerades med “Register_OCT_2”. Det gör du antingen genom att bläddra igenom EnFaceStack, välja fönstret Enface Stack eller klicka på vänster- eller högerpilen. Observera att namnet på modaliteten visas i det övre vänstra hörnet. För att bättre inspektera och markera lesionerna, zooma in i Bscan-fönstret. Klicka på B-Scan-fönstret , peka med musen i den riktning du vill zooma in och tryck på + -tangenten. För att zooma ut, tryck på -tangenten. Bläddra genom BScan-stapeln genom att rulla uppåt eller nedåt på musen, dra fältet längst ner till vänster eller höger för att gå igenom skanningen, eller genom att välja B-Scan-ramen och klicka på vänster och höger piltangenter på tangentbordet. Observera att en översikt över det aktuella området i BScan-stacken tillhandahålls av den röda linjen i EnFaceStack-fönstret och längst upp till vänster i BScan-fönstret där BScan-numret (t.ex. 31/120) visas. Klicka på OK för att skapa en ny .tsv-fil i motsvarande mapp “OD_OCT” eller “OS_OCT”. Observera att .tsv-filnamnet består av “Mark_Bscans_OCT” plus det ärende-ID som angavs, lateraliteten och modaliteten som valdes i det sista steget i Mark_Bscans_OCT. Dessutom kommer färgkodade “iso-skrov” av drusen nu att visas i EnFaceStack.

Representative Results

Visa utdataFör att på ett adekvat sätt analysera och dra slutsatser från resultaten är det viktigt att förstå utdatafilen för Mark_Bscans_OCT. De tre första kolumnerna är märkta efter ärende-ID:t, filens lateralitet och den avbildningsmodalitet som valdes. Den fjärde kolumnen refereras till av läge och är märkt z-poäng. Observera att när den här texten skrivs kan Mark BScans bara beräkna alla lesioner på en gång; Raderna avser isoskrov, vars avstånd från skadans ytterkant anges i de nedre och övre kolumnerna i kalkylbladet. Iso-skrov mäter AF i z-poäng (vid QAF) i en specificerad omkrets som omger lesionen. Observera att det minsta värdet för en pixel i ett isoskrov finns i kolumnerna med etiketten min, kolumnerna med etiketterna median, max, mean och stdev innehåller median, maximum, medelvärde och standardavvikelse för medelvärdet av pixelvärdena i ettisoskrov. Kolumnen n innehåller det totala antalet pixlar i ett isoskrov. Figur 1 visar en singulär markerad mjuk drusen hos en 84-årig manlig patient med intermediär åldersrelaterad makuladegeneration (iAMD). Figur 2 visar det vänstra ögat hos en representativ patient med SDD markerade med QAF-Workflow-verktyget (Figur 3). SDD hos denna patient var associerad med minskat förmaksflimmer (z-score = -0,4 ± 0,2). På samma sätt uppvisade isoskroven runt SDD reducerad AF (t.ex. närmaste isoskrov = -0,3 ± 0,3) jämfört med StandardRetina. En trolig förklaring till detta fenomen kan vara skuggeffekter (minskad translucens) av SDD-lesioner på RPE. Användningen av SDD var exemplarisk. Verktyget gör det möjligt att bedöma lokala AF-nivåer även i andra lesioner, till exempel drusen. Dessutom gör verktyget det möjligt att spåra AF-förändringar från lesioner över tid. Figur 1: En singulär markerad mjuk drusen hos en 84-årig manlig patient med intermediär åldersrelaterad makuladegeneration (iAMD). (A) QAF-bilden av ett vänster öga med den markerade drusen. (B) Närbild av drusen: brun mitt som representerar den markerade drusen och färgade band som representerar de omgivande isoskroven. Tabellen nedan visar utdatafilen. QAF drusen-värden jämförs med motsvarande QAF-värden för motsvarande excentricitet från StandardRetina. Detta resulterar i z-poäng som representerar avvikelse från medelvärdet för opåverkade områden. Den blå rutan visar från vänster till höger: ärende-ID, ögats lateralitet, modalitet som används och önskad utdata (i det här fallet z-poäng). Kolumnerna i den orange rutan visar gränserna för det uppmätta området i millimeter (nedre = nedre gräns, övre = övre gräns). Den gröna rutan etiketterar kolumnerna som visar QAF-måtten. Från vänster till höger innehåller dessa medelvärdets minimum, median, maximum, antal pixlar, medelvärde och standardavvikelse. Varje rad representerar ett isoskrov, rader i den blå rutan representerar värden inom lesionen och rader i den lila rutan visar isoskroven som omger varje lesion (uppifrån och ned med ökande avstånd till lesionen). Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Markerade SDD:er i en QAF-bild av en 80-årig kvinnlig patient med tidig AMD. (A) SDD:er kan ses i QAF-bilden. Samma QAF-bild visas med präglade anteckningar av SDD:er. (B) Runt varje markerad lesion är isoskroven avbildade med färgkodning (ljusgrön, mörkgrön och röd). (C) En förstorad version av den blå rektangeln. Den yttre kanten på varje SDD är markerad med blått. Förkortningar: QAF = kvantitativ autofluorescens; AMD = åldersrelaterad makuladegeneration; SDD = subretinal drusenoid insättning. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Arbetsflöde för att bestämma AF av lesioner. Den här figuren visualiserar de plugin-program som behövs för att fastställa lesionsspecifik AF. (A) Bilden visar en färgkodad QAF-bild som kan användas för att visualisera fördelningen av QAF-värden, men som inte bör användas för vidare analys. (B) En QAF-bild i förgrunden, med den infraröda bilden från SD-OCT-skanningen i bakgrunden, visas. Detta är tänkt att visualisera inriktningen med hjälp av kärlförgreningar. Detta kan göras med hjälp av Register_OCT_2 plug-in. C) En StandardRetina som används för att mäta z-värdena för lesioner. StandardRetinas kan skapas med hjälp av StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) En BScan med blå pilar som pekar på SDD, som är markerade med gula linjer (obs: lesioner är alltid markerade under RPE oberoende av platsen i z-riktningen) avbildas. (E) Alla markerade lesioner ses präglade på en QAF-bild (se figur 1). De två sista stegen görs med hjälp av plugin-programmet Mark_BScans_OCT. Förkortningar: AF = autofluorescens; QAF = kvantitativ autofluorescens; SDD = subretinal drusenoid avlagring; IR = infraröd; RPE = retinalt pigmentepitel; SD-OCT = spektraldomän optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Det här arbetsflödet innehåller en steg-för-steg-guide för att använda FIJI-plugin-verktyg med öppen källkod för att fastställa och jämföra AF för AMD-specifika lesioner. Plugin-programmen tillhandahåller lättanvända mallar som inte kräver någon kodningskunskap och som kan tillämpas av läkare utan teknisk support²⁷. Såvitt vi vet är dessa verktyg unika för lesionsspecifik AF-kvantifiering.

QAF-värdena varierar naturligt över näthinnan, med värden som är högre i periferin och lägre i gula fläcken på grund av ojämn fördelning av lipofuscin och melanolipofuscin i näthinnan, kärlens låga AF och ojämn fördelning av makulapigment. På grund av den höga variationen av naturligt förekommande QAF-nivåer i näthinnan är det inte ett lovande tillvägagångssätt att analysera absoluta QAF-värden för lesioner direkt. Till exempel kan en hypoautofluorescerande lesion i periferin fortfarande ha högre absoluta QAF-värden än fysiologiska fluorescensnivåer i gula fläcken. Användningen av en StandardRetina och användningen av z-poäng för att mäta fluorescensnivåerna av drusen korrigerar för denna naturligt förekommande varians av QAF-värden.

En z-poäng är ett numeriskt mått på ett värde för en region av intresse för förhållandet till medelvärdet i StandardRetina. Det beräknas genom att subtrahera medelvärdet från en individ från medelvärdet från StandardRetina på samma plats och sedan dividera resultatet med standardavvikelsen. Denna standardisering gör det möjligt att jämföra olika QAF-bilder, eftersom z-poängen anger hur många standardavvikelser ett värde skiljer sig från medelvärdet. En positiv z-poäng indikerar att värdet ligger över medelvärdet, medan en negativ z-poäng indikerar att det ligger under medelvärdet.

Det är viktigt att notera att det kan finnas potentiella fallgropar som bör övervägas. Även om denna metod tar hänsyn till den varierande mängden AF-nivåer i hela fundus, är det kanske fortfarande inte det mest exakta sättet att mäta och jämföra en RPE:s AF. Individer har olika nivåer och topografi av makulalutealpigment, och lesioner kan också påverka translucensen i den överliggande näthinnan ^28,29. Det är därför troligt att den uppmätta minskade AF i områden med SDD (se representativa resultat) är en konsekvens av skuggningseffekter snarare än minskade fluoroforer i RPE^30,31,32.

Vi arbetar för närvarande med ett arbetsflöde för att ta hänsyn till retinal reflektivitet, tjocklek och kvantifierat makulapigment (med hjälp av grön och blå AF) med linjära blandade modeller. Dessutom använder QAF hittills en åldersberoende korrigeringsfaktor för att ta hänsyn till lentikulär opacifiering som bortser från interindividuella skillnader i lentikulär opacifiering hos deltagare i samma ålder som³³. Vi arbetar därför för närvarande med ett arbetsflöde för en personlig korrektionsfaktor för lentikulär autofluorescens och opacifiering. För att på ett tillförlitligt sätt extrahera information om AF från små lesioner krävs adekvat test-omtest-tillförlitlighet för QAF-bilder. För att ytterligare särskilja de QAF-bilder där mer detaljerad analys är genomförbar undersöker vi “QAF-bildtillförlitlighetsindex” som kan förutsäga test-omtest-tillförlitligheten för QAF-bilder. I det nuvarande skedet är det kloka tillvägagångssättet att ta dubbla bilder och undersöka tillförlitligheten hos lesionsspecifik AF.

Den presenterade metoden för att dessutom analysera iso-skrov av lesioner var tekniskt svår att implementera, eftersom iso-skrov av närliggande lesioner smälter samman. Områden med sammanslagna isoskrov kan karakteriseras distinkt beroende på vilken skada som avses. Vår lösning var att betrakta alla lesioner av en typ som en lesion och att analysera deras periferi som ett skarvskrov. Denna metod minskar dock drastiskt möjligheten att mäta isoskrov hos enskilda drusen och kan betraktas som ytterligare en fallgrop med denna teknik. Mer tekniskt sofistikerade metoder för att ta hänsyn till sammanslagna isoskrov eller avbruten rapportering av förmaksflimmer i områden med sammanslagna isoskrov skulle kunna underlätta analysen av förmaksflimmer i omkretsen av lesioner i framtiden.

Vi använde AMD som modellsjukdom för denna studie. Arbetsflödet kan anpassas för att studera lesioner även vid andra sjukdomar. Hittills har QAF använts vid många korioretinala sjukdomar, inklusive recessiv Stargardts sjukdom, Bestrophin-1-associerade sjukdomar, olika former av retinitis pigmentosa, akut zonal ockult yttre retinopati, pseudoxanthoma elasticum och andra 17,33,34,35,36,37. Eftersom det här arbetsflödet använder programvara med öppen källkod uppmuntrar vi andra att duplicera detta arbete för att fastställa lesionsspecifik AF och utöka vår kunskap om näthinnesjukdomar. Sammanfattningsvis presenterar vi ett arbetsflöde för att bestämma och jämföra AF-nivåer för olika näthinneskador i hela gula fläcken. Detta arbetsflöde banar väg för mer djupgående analyser av förmaksflimmer och kan underlätta utvecklingen av nya biomarkörer inom AMD och därefter.

Materials

BatchStandardRetina plugin	n.a.	n.a.	n.a.
FIJI (Image J)	n.a.	n.a.	n.a.
Mark_Bscans_OCT plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Microspft office	Microsoft	n.a.	n.a.
QAF_xml_reader plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Register_OCT_2 plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Spectralis	Heidelberg Engineering	n.a.	QAF extension
StandardRetina plugin	n.a.	n.a.	n.a.