Summary

Ex Vivo Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

Les tests de laboratoire peuvent tirer parti de la valeur pronostique de l’imagerie multimodale longitudinale de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) basée sur la tomographie longitudinale par cohérence optique (OCT). Les yeux des donneurs humains avec et sans DMLA sont imagés à l’aide de l’OCT, de la couleur, de l’ophtalmoscopie laser à balayage dans le proche infrarouge et de l’autofluorescence à deux longueurs d’onde d’excitation avant la section des tissus.

Abstract

Une séquence de progression pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) apprise à partir de l’imagerie clinique multimodale (MMI) basée sur la tomographie par cohérence optique (OCT) pourrait ajouter une valeur pronostique aux résultats de laboratoire. Dans ce travail, l’OCT ex vivo et le MMI ont été appliqués aux yeux de donneurs humains avant la section du tissu rétinien. Les yeux ont été récupérés sur des donneurs blancs non diabétiques âgés de ≥80 ans, avec un temps de décès à la préservation (DtoP) de ≤6 h. Les globes ont été récupérés sur place, marqués avec une tréphine de 18 mm pour faciliter l’élimination de la cornée, et immergés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4%. Les images du fond d’œil couleur ont été acquises après le retrait du segment antérieur avec une lunette de dissection et un appareil photo reflex utilisant un éclairage trans, épi- et flash à trois grossissements. Les globes ont été placés dans un tampon dans une chambre conçue sur mesure avec une lentille de 60 dioptries. Ils ont été imagés avec le domaine spectral OCT (cube de macula de 30°, espacement de 30 μm, moyenne = 25), la réflectance dans le proche infrarouge, l’autofluorescence de 488 nm et l’autofluorescence de 787 nm. Les yeux de la DMLA ont montré un changement dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), avec des dépôts drusen ou drusenoïdes sous-rétiniens (SDD), avec ou sans néovascularisation, et sans preuve d’autres causes. Entre juin 2016 et septembre 2017, 94 yeux droits et 90 yeux gauches ont été récupérés (DtoP : 3,9 ± 1,0 h). Sur les 184 yeux, 40,2 % avaient une DMLA, y compris une DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %) et néovasculaire (9,8 %), et 39,7 % avaient des macules banales. Drusen, SDD, foyers hyperréfléchissants, atrophie et cicatrices fibrovasculaires ont été identifiés à l’aide de l’OCT. Les artefacts comprenaient une opacification des tissus, des décollements (bacillaires, rétiniens, EPR, choroïdiens), un changement kystique fovéal, un EPR ondulant et des dommages mécaniques. Pour guider la cryosection, des volumes OCT ont été utilisés pour trouver les repères de la fovéa et de la tête du nerf optique et des pathologies spécifiques. Les volumes ex vivo ont été enregistrés avec les volumes in vivo en sélectionnant la fonction de référence pour le suivi oculaire. La visibilité ex vivo de la pathologie observée in vivo dépend de la qualité de conservation. En 16 mois, 75 yeux de donneurs DtoP rapides à tous les stades de la DMLA ont été récupérés et stadifiés à l’aide de méthodes cliniques MMI.

Introduction

Quinze années de prise en charge de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge (DMLA) avec un traitement anti-VEGF sous la direction de la tomographie par cohérence optique (OCT) ont offert de nouvelles perspectives sur la séquence de progression et la microarchitecture de cette cause répandue de perte de vision. Une reconnaissance clé est que la DMLA est une maladie tridimensionnelle impliquant la rétine neurosensorielle, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la choroïde. Grâce à l’imagerie OCT des patients de l’essai et des yeux des patients traités en clinique, les caractéristiques de la pathologie au-delà de celles observées par la photographie couleur du fond d’œil, une norme clinique depuis des décennies, sont maintenant reconnues. Il s’agit notamment de la néovascularisation intrarétinienne (néovascularisation maculaire de type 3 1, anciennement prolifération angiomateuse), des dépôts druzenoïdes sous-rétiniens (SDD, également appelés pseudodruzen réticulaires)2, des voies multiples du destin RPE3,4 et des cellulesde Müller intensément gliotiques dans l’atrophie 5,6.

Les systèmes modèles dépourvus de maculas (cellules et animaux) recréent quelques tranches de cette maladie complexe 7,8,9. Un autre succès dans l’amélioration du fardeau de la DMLA pourrait provenir de la découverte et de l’exploration de la pathologie primaire dans les yeux humains, de la compréhension de la composition cellulaire unique de la macula, suivie de la traduction en systèmes modèles. Ce rapport décrit une collaboration de trois décennies entre un laboratoire de recherche universitaire et une banque d’yeux. Les objectifs des méthodes de caractérisation tissulaire décrites ici sont doubles : 1) éclairer l’évolution de la technologie diagnostique en démontrant la base de l’apparence du fond d’œil et des sources de signaux d’imagerie par microscopie, et 2) classer les échantillons de DMLA pour des techniques de découverte moléculaire ciblées (immunohistochimie) et non ciblées (spectrométrie de masse d’imagerie, IMS et transcriptomique spatiale) qui préservent la fovéa conique et la para- et périfovéa riches en bâtonnets. De telles études pourraient accélérer la traduction en OCT clinique, pour laquelle une séquence de progression et un suivi longitudinal sont possibles grâce au suivi oculaire. Cette technologie, conçue pour surveiller les effets du traitement, enregistre les scans d’une visite clinique à l’autre à l’aide de vaisseaux rétiniens. L’établissement d’un lien entre la TCO suivie oculaire et les résultats de laboratoire obtenus à l’aide de techniques destructrices pourrait fournir un nouveau niveau de valeur pronostique aux résultats moléculaires.

En 1993, le laboratoire de recherche a capturé des photographies couleur de fond d’œil post-mortem sur film10. Cet effort a été inspiré par la superbe photomicroscopie et histologie de la rétine périphérique humaine par Foos et ses collègues 11,12,13 et les corrélations clinicopathologiques étendues de la DMLA par Sarks et al.14,15. À partir de 2009, l’imagerie multimodale ex vivo (MMI) ancrée sur le domaine spectral OCT a été adoptée. Cette transition a été inspirée par les efforts similaires d’autres 16,17 et surtout par la prise de conscience qu’une grande partie de l’ultrastructure décrite par les Sercs était disponible en trois dimensions, au fil du temps, dans la clinique 18,19. L’objectif était d’acquérir des yeux avec des maculas attachées dans un délai raisonnable pour des études bien puissantes des phénotypes au niveau cellulaire dans la rétine, l’EPR et la choroïde. L’intention était d’aller au-delà des statistiques « par œil » pour aller au-delà des statistiques « par type de lésion », une norme influencée par les concepts de « plaque vulnérable » des maladies cardiovasculaires20,21.

Le protocole présenté dans le présent rapport reflète l’expérience acquise avec près de 400 paires d’yeux de donneurs acquises dans plusieurs flux. En 2011-2014, le site Web du projet MACULA sur l’histopathologie de la DMLA a été créé, qui comprend des épaisseurs de couche et des annotations provenant de 142 spécimens archivés. Ces yeux ont été conservés de 1996 à 2012 dans un fixateur glutaraldéhyde-paraformaldéhyde pour l’histologie époxy-résine haute résolution et la microscopie électronique. Tous les fundi avaient été photographiés en couleur lors de leur réception et ont été réimagés par OCT juste avant l’histologie. Un porte-œil conçu à l’origine pour les études du nerf optique22 a été utilisé pour accueillir un poinçon tissulaire de 8 mm de diamètre sur toute l’épaisseur centré sur la fovéa. Des scans OCT B à travers le centre fovéal et un site supérieur de 2 mm, correspondant à l’histologie aux mêmes niveaux, ont été téléchargés sur le site Web, ainsi qu’une photographie du fond d’œil en couleur. Le choix des plans OCT a été dicté par l’importance de la pathologie AMD sous la fovéa23 et l’importance des SDD dans les zones riches en bâtonnets supérieures à la fovéa24,25.

À partir de 2013, les yeux imagés avec un MMI ancré dans les OCT pendant la vie étaient disponibles pour des corrélations clinicopathologiques directes. La plupart (7 donneurs sur 10) impliquaient des patients dans une pratique de référence de la rétine (auteur: K.B.F.), qui offrait un registre de directives avancées pour les patients intéressés à donner leurs yeux après leur décès à des fins de recherche. Les yeux ont été récupérés et préservés par la banque d’yeux locale, transférés au laboratoire et préparés de la même manière que les yeux du projet MACULA. Les volumes cliniques d’OCT pré-mortem ont été lus de manière transparente en laboratoire, alignant ainsi les caractéristiques pathologiques observées au cours de la vie avec les caractéristiques observées au microscope26.

À partir de 2014, le prélèvement prospectif sur les yeux a commencé par le dépistage de la DMLA dans les yeux de donneurs sans antécédents cliniques, mais conservés pendant un délai défini (6 h). À cette fin, le porte-œil a été modifié pour accueillir un globe entier. Cela réduisait le risque de détachement autour des bords coupés du poinçon de 8 mm précédemment utilisé. Les yeux ont été conservés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4% pour l’immunohistochimie et transférés à 1% le lendemain pour un stockage à long terme. En 2016-2017 (avant la pandémie), 184 yeux de 90 donneurs ont été récupérés. Les statistiques et les images de ce rapport sont générées à partir de cette série. Pendant la période pandémique (confinements de 2020 et conséquences), les collectes potentielles pour la transcriptomique et les collaborations IMS se sont poursuivies à un rythme réduit, utilisant essentiellement les méthodes de 2014.

D’autres méthodes d’évaluation oculaire du donneur sont disponibles. Le Minnesota Grading System (MGS)27,28 est basé sur le système clinique AREDS pour la photographie couleurdu fond d’œil 29. Les limites de cette méthode comprennent la combinaison de la DMLA atrophique et néovasculaire en un seul stade de « DMLA tardive ». De plus, le MGS implique l’ablation de la rétine neurosensorielle avant la photo-documentation de la choroïde RPE. Cette étape déloge les SDD à des degrés divers30,31 et supprime la correspondance spatiale de la rétine externe et de son système de support. Ainsi, les efforts visant à lier la demande métabolique et la signalisation de la rétine à la pathologie de l’EPR-choroïde peuvent être entravés. Le système de l’Utah a mis en œuvre le MMI en utilisant la photographie couleur ex vivo et l’OCT pour catégoriser les yeux destinés à la dissection en régions pour les extractions d’ARN et de protéines32. Bien que préférable aux extractions d’œillets entiers, la zone de 3 mm de diamètre présentant le risque le plus élevé de progression de la DMLA33,34 ne représente que 25% d’un poinçon centré sur la fovéa de 6 mm de diamètre. Ainsi, les techniques qui permettent de localiser les résultats en référence à la fovéa, telles que la coupe en série pour l’immunohistochimie, sont avantageuses.

Protocol

Le comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Alabama à Birmingham a approuvé les études de laboratoire, qui ont adhéré aux bonnes pratiques de laboratoire et au niveau de biosécurité 2/2+. Toutes les banques ophtalmologiques américaines sont conformes à la loi de 2006 sur les cadeaux anatomiques uniformes et à la Food and Drug Administration des États-Unis. La plupart des banques ophtalmologiques américaines, y compris Advancing Sight Network, sont conformes aux normes médicales de l’Eye …

Representative Results

Le tableau 1 montre qu’en 2016-2017, 184 yeux de 94 donneurs blancs non diabétiques âgés de >80 ans ont été récupérés. Le temps moyen de décès jusqu’à la préservation était de 3,9 h (intervalle : 2,0-6,4 h). Sur les 184 yeux examinés, 75 (40,2%) avaient une certaine DMLA. Les catégories suivantes ont été identifiées : banale (39,7 %), douteuse (11,4 %), DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %), néovasculaire (9,8 %), autre (8,7 %) et inconnue/non enregistrée/non g…

Discussion

En utilisant une approche de dépistage basée sur la population pendant une période de 16 mois dans l’ère pré-COVID, il a été possible d’obtenir 75 yeux de donneurs atteints de DMLA. Tous ont été récupérés avec un DtoP court et mis en scène à l’aide de MMI ancrés dans les OCT. Le critère d’âge (>80 ans) se situe en dehors de la tranche d’âge typique pour les récupérations tissulaires destinées aux cornées transplantables. Malgré l’âge avancé, nos critères ont abouti à des yeux à tou…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Heidelberg Engineering pour l’instrumentation et la conception du porte-œil original, Richard F. Spaide MD pour l’introduction à l’imagerie multimodale basée sur OCT, Christopher Girkin MD pour avoir facilité l’accès aux dispositifs d’imagerie clinique et David Fisher pour la figure 1. La récupération des yeux de donneurs humains pour la recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) et U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), l’EyeSight Foundation of Alabama, l’International Retinal Research Foundation (C.A.C.), l’Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) et Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

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Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

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