סינתזה ישירה של ננו-חלקיקי זהב גלויים EM בתאים לניתוח לוקליזציה של חלבונים עם מבנה אולטרה שמור היטב
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.
Abstract
ניתוח הלוקליזציה המדויקת של מולקולות חלבון בתאים בעלי רזולוציה אולטרה-מבנית הוא בעל משמעות רבה לחקר תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים בכל האורגניזמים החיים. לכן, הפיתוח של תגים ניתנים לשיבוט שיכולים לשמש כבדיקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא בעל ערך רב, בדיוק כפי שחלבונים פלואורסצנטיים מילאו תפקיד מכריע בתחום הדימות האופטי. לאחרונה נחשף מנגנון דיכוי האוטונוקלציה (ANSM), המאפשר סינתזה ספציפית של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על תגים עשירים בציסטאין, כגון מטלותיונין (MT) וחלבון נוגד קיפאון (AFP).
על בסיס ה-ANSM פותחה טכנולוגיית תיוג במיקרוסקופ אלקטרונים, המאפשרת זיהוי ספציפי של חלבונים מתויגים בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים ביעילות תיוג חסרת תקדים. מחקר זה מדגים פרוטוקול לזיהוי חלבוני היתוך MTn (גרסה מהונדסת של MT החסרה שאריות אלדהיד-תגובתי) בתאי יונקים בעלי מבנה אולטרה-מבנה שמור היטב. בפרוטוקול זה, קיבוע הקפאה ותחליפי הקפאה בלחץ גבוה בוצע באמצעות קיבוע שאינו אלדהיד (כגון חומצה טאנית, אורניל אצטט) כדי לשמר מבנה אולטרה כמעט טבעי ולמנוע נזק לפעילות התג הנגרמת על ידי הצלבת אלדהיד.
התייבשות פשוטה בצעד אחד שימשה לפני סינתזת AuNP מבוססת ANSM. התוצאות הראו כי החלבונים המתויגים התמקדו באברונים שונים, כולל הממברנות והלומן של הרשתית האנדופלסמית (ER), ומטריצות מיטוכונדריאליות זוהו ביעילות וספציפיות גבוהות. מחקר זה מספק לביולוגים פרוטוקול חזק כדי לענות על מגוון עצום של שאלות ביולוגיות ברמת המולקולה הבודדת בהקשרים אולטרה-מבניים תאיים.
Introduction
בעידן הפוסט-גנומי, פיתוחו של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ככתב בעל מולקולה בודדת למיקרוסקופ אור חולל מהפכה בתחום המחקר המודרני במדעי החיים 1,2. במשך עשרות שנים, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) היה כלי רב עוצמה להתבוננות אינטואיטיבית באולטרה-מבנה התאי ברזולוציה ננומטרית3; עם זאת, הזיהוי והלוקליזציה המדויקים של מולקולות חלבון נותרו מאתגרים.
טכניקת התיוג הנפוצה ביותר של קרינה אלקטרומגנטית היא טכניקת התיוג במיקרוסקופ אימונואלקטרונים (IEM), המבוססת על תגובת האנטיגן-נוגדנים. עם זאת, למרות שפותחו טכניקות רבות בתחום התיוג IEM, כולל הטבעה מראש של IEM והטבעה לאחר הטבעה של IEM (על קטעי שרף או קריוסקציות לחות), הוא עדיין סובל מיעילות תיוג נמוכה (<10%)4,5, הקשורה להכנת הדגימה ואיכות הנוגדנים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, לפיתוח תגים מקודדים גנטית יש פוטנציאל יישומי גדול.
שני סוגים עיקריים של תגי EM נחקרו ביסודיות בשנים האחרונות. סוג אחד הוא שיטת צביעת DAB, המשתמשת בתגים כגון APEX2 כדי לחמצן 3,3′-diaminobenzidine (DAB) לפולימרים אוסמיופיליים להדמיית EM 6,7,8,9,10,11,12. הוא מאפשר תיוג של חלבונים בשפע גבוה באזורים תת-תאיים, אך אינו מתאים לספירת מולקולות בודדות. הסוג השני משתמש בחלבונים קושרי מתכות, כגון פריטין 13 ומתלותיונין (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, כדי ליצור מרבצי מתכת צפופים אלקטרונים ב situ עבור הדמיית EM. רק לאחרון יש פוטנציאל אמיתי להדמיה וספירה של מולקולה אחת. הגודל המולקולרי של פריטין גדול מדי (~ 450 kD) מכדי שניתן יהיה להשתמש בו כתג מבטיח, בעוד שהגודל הקטן (~ 5 kD) של MT ויכולתו לקשור יונים שונים דרך 20 הציסטאין שלו משכו תשומת לב רבה. מספר מעבדות ניסו לתייג חלבוני MT-fusion מטוהרים או תאים המבטאים MT על ידי דגירה ישירה עם Au+. ניסיונות אלה הוכיחו בתחילה כי תגי MT יכולים לקשור יוני זהב ליצירת אותות בעלי ניגודיות גבוהה, אך אף אחד מהם לא באמת השיג את הזיהוי היעיל של חלבונים בודדים בתאים, והם אינם ישימים באופן נרחב 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM, הכוללת סינתזה של AuNPs בגודל 2-6 ננומטר ישירות על תגים עשירים בציסטאין (למשל, MT, גרסאות MT MTn ו- MTα, AFP) כתוויות צפופות אלקטרונים להדמיית EM, היא הגישה האמינה והישימה הראשונה לתיוג חלבונים וזיהוי מולקולות בודדות בתאים24,25,26. הוא מאפשר סינתזה ספציפית של AuNPs על חלבוני היתוך תגים מבודדים והשיג יעילות תיוג חסרת תקדים בתאים פרוקריוטים לא קבועים או קבועים כימית (E. coli) ואיקריוטים (S. pombe). עם זאת, יישום אותו פרוטוקול במערכות מתקדמות יותר כגון תאי יונקים או אפילו רקמות כרוך באתגרים נוספים, כגון הומאוסטזיס חיזור תוך-תאי מורכב יותר ומבנה תאי שברירי יותר.
מחקר זה מציג טכנולוגיית תיוג EM הניתנת לשיבוט, המשלבת את טכניקת הסינתזה החדשנית מבוססת ANSM AuNP לתיוג תגים עשירים בציסטאין מקודדים גנטית (MT) עם שיטת הכנת הדגימות HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, מאפשרת זיהוי חד-משמעי של מולקולות בודדות של חלבונים מתויגים בקרום ER, לומן ER ומטריצת מיטוכונדריה בתאי HeLa. השיטה הנוכחית משלבת מאפיינים של יעילות תיוג גבוהה, יחס אות לרעש גבוה, תיוג של מולקולה בודדת ואוניברסליות חזקה, ולשיטה זו יש סיכויי יישום רחבים במחקר מדעי החיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר מציג כאן טכנולוגיית תיוג EM חזקה הניתנת לשיבוט להדמיית מולקולות בודדות של מולקולות חלבון בסביבה התאית עם רזולוציה אולטרה-מבנית. AuNPs המסונתזים ישירות על תגים עשירים בציסטאין המקודדים גנטית מספקים לוקליזציה חד משמעית ומדויקת של חלבוני המטרה. טכניקת הקפאה והחלפת הקפאה בלחץ גבוה משמרת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרוטוקול המתואר כאן נגזר מהמאמר שפורסם על ידי Jiang et al. (2020). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של MOST (973 תוכניות מס ‘2011CB812502 ו 2014CB849902) ועל ידי מימון תמיכה מהממשלה העירונית בייג’ינג.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
