Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata
Summary
Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d’oro basata sul meccanismo di soppressione dell’autonucleazione.
Abstract
Analizzare la localizzazione precisa delle molecole proteiche nelle cellule con risoluzione ultrastrutturale è di grande importanza per lo studio di vari processi fisiologici o patologici in tutti gli organismi viventi. Pertanto, lo sviluppo di tag clonabili che possono essere utilizzati come sonde di microscopia elettronica è di grande valore, così come le proteine fluorescenti hanno svolto un ruolo cruciale nel campo dell’imaging ottico. Recentemente è stato scoperto il meccanismo di soppressione dell’autonucleazione (ANSM), che consente la sintesi specifica di nanoparticelle d’oro (AuNP) su tag ricchi di cisteina, come metallotioneina (MT) e proteina antigelo (AFP).
Sulla base dell’ANSM, è stata sviluppata una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico, che consente la rilevazione specifica di proteine marcate in cellule procariotiche ed eucariotiche con un’efficienza di marcatura senza precedenti. Questo studio illustra un protocollo per la rilevazione di proteine di fusione MTn (una variante MT ingegnerizzata priva di residui aldeidico-reattivi) in cellule di mammifero con ultrastruttura ben conservata. In questo protocollo, il congelamento ad alta pressione e la fissazione del congelamento-sostituzione sono stati eseguiti utilizzando fissativi non aldeidici (come acido tannico, acetato di uranile) per preservare l’ultrastruttura quasi nativa ed evitare danni all’attività del tag causati dalla reticolazione aldeidica.
Una semplice reidratazione in un solo passaggio è stata utilizzata prima della sintesi AuNP basata su ANSM. I risultati hanno mostrato che le proteine marcate hanno preso di mira vari organelli, tra cui le membrane e il lume del reticolo endoplasmatico (ER), e le matrici mitocondriali sono state rilevate con elevata efficienza e specificità. Questa ricerca fornisce ai biologi un protocollo robusto per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche a livello di singola molecola in contesti ultrastrutturali cellulari.
Introduction
Nell’era postgenomica, lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter a singola molecola per la microscopia ottica ha rivoluzionato il campo della moderna ricerca sulle scienze della vita 1,2. Per decenni, la microscopia elettronica (EM) è stata un potente strumento per osservare intuitivamente l’ultrastruttura cellulare con risoluzione su scala nanometrica3; Tuttavia, l’identificazione precisa e la localizzazione delle molecole proteiche rimangono impegnative.
La tecnica di marcatura EM più comunemente usata è la tecnica di marcatura al microscopio immunoelettronico (IEM), che si basa sulla reazione antigene-anticorpo. Tuttavia, sebbene siano state sviluppate molte tecniche nel campo dell’etichettatura IEM, tra cui IEM pre-embedding e IEM post-embedding (su sezioni di resina o criosezioni idratate), soffre ancora di bassa efficienza di etichettatura (<10%)4,5, che è correlata alla preparazione del campione e alla qualità degli anticorpi. Per superare queste limitazioni, lo sviluppo di tag geneticamente codificati ha un grande potenziale applicativo.
Due tipi principali di tag EM sono stati accuratamente esplorati negli ultimi anni. Un tipo è il metodo di colorazione DAB, che utilizza tag come APEX2 per ossidare 3,3′-diaminobenzidina (DAB) in polimeri osmiofili per la visualizzazione EM 6,7,8,9,10,11,12. Consente la marcatura di proteine ad alta abbondanza nelle regioni subcellulari, ma non è adatto per il conteggio di singole molecole. L’altro tipo utilizza proteine leganti i metalli, come la ferritina 13 e la metallotioneina (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, per generare depositi metallici densi di elettroni in situ per la visualizzazione EM. Solo quest’ultimo ha un reale potenziale per la visualizzazione e il conteggio di singole molecole. La dimensione molecolare della ferritina è troppo grande (~450 kD) per essere usata come tag promettente, mentre le piccole dimensioni (~5 kD) della MT e la sua capacità di legare vari ioni attraverso le sue 20 cisteine hanno attirato grande attenzione. Diversi laboratori hanno cercato di etichettare le proteine purificate di fusione MT o le cellule che esprimono MT incubando direttamente con Au+. Questi tentativi hanno inizialmente dimostrato che i tag MT possono legare gli ioni d’oro per formare segnali ad alto contrasto, ma nessuno ha realmente raggiunto l’identificazione efficace delle singole proteine nelle cellule, e non sono ampiamente applicabili 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM, che prevede la sintesi di AuNP di dimensioni 2-6 nm direttamente su tag ricchi di cisteina (ad esempio, MT, le varianti MT MTn e MTα, AFP) come etichette ad alta densità di elettroni per la visualizzazione EM, è il primo approccio affidabile e applicabile per l’etichettatura delle proteine e il rilevamento di singole molecole nelle cellule24,25,26. Permette la sintesi specifica di AuNPs su proteine isolate di fusione tag e ha raggiunto un’efficienza di marcatura senza precedenti in cellule procariotiche (E. coli) ed eucariotiche (S. pombe) non fisse o chimicamente fissate. Tuttavia, l’implementazione dello stesso protocollo in sistemi più avanzati come le cellule di mammifero o persino i tessuti comporta ulteriori sfide, come la più complessa omeostasi redox intracellulare e la struttura cellulare più fragile.
Questo studio presenta una tecnologia di etichettatura EM clonabile, che combina la nuova tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM per l’etichettatura di tag ricchi di cisteina geneticamente codificati (MT) con il metodo di preparazione del campione HPF / FSF reidratazione HPF / FSF, consente l’identificazione univoca di singole molecole di proteine marcate nella membrana ER, nel lume ER e nella matrice mitocondriale nelle cellule HeLa. Il metodo attuale combina le caratteristiche di un’elevata efficienza di etichettatura, un elevato rapporto segnale-rumore, etichettatura a singola molecola e forte universalità, e questo metodo ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca sulle scienze della vita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio presenta qui una robusta tecnologia di etichettatura EM clonabile per la visualizzazione di singole molecole di molecole proteiche all’interno dell’ambiente cellulare con risoluzione ultrastrutturale. Le AuNP sintetizzate direttamente su tag ricchi di cisteina geneticamente codificati forniscono una localizzazione univoca e precisa delle proteine bersaglio. La tecnica di congelamento ad alta pressione e di congelamento preserva in modo eccellente l’ultrastruttura dei campioni biologici. Nel complesso, la tecnol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il protocollo qui descritto è stato derivato dall’articolo pubblicato da Jiang et al. (2020). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del MOST (973 Programmi n. 2011CB812502 e 2014CB849902) e dal sostegno finanziario del governo municipale di Pechino.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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