السطور الوعائية أمر حيوي لتوليد إمكانات القوقعة الداخلية. هنا ، نقدم تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ لتسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة.
تعد إمكانات Endocochlear ، التي يتم إنشاؤها بواسطة السطور الوعائية ، ضرورية للحفاظ على بيئة مواتية للنقل الميكانيكي المناسب لخلايا الشعر والسمع في نهاية المطاف. يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية السطورية إلى انخفاض السمع. يسمح تشريح الأوعية الدموية للخطوط البالغة بالتقاط نواة واحدة مركزة وتسلسل النواة المفردة اللاحقة والبقع المناعية. تستخدم هذه التقنيات لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأوعية الدموية السعيرة على مستوى الخلية الواحدة.
يمكن استخدام تسلسل النواة المفردة في إعداد التحليل النسخي للأوعية الدموية السطورية. وفي الوقت نفسه، لا يزال التلوين المناعي مفيدا في تحديد مجموعات معينة من الخلايا. تتطلب كلتا الطريقتين تشريح الأوعية الدموية المناسب كشرط أساسي ، والذي يمكن أن يكون تحديا تقنيا.
تتكون القوقعة من ثلاث غرف مملوءة بالسوائل ، سكالا الدهليز ، سكالا ميديا ، وسكالا تيمباني . يحتوي كل من سكالا الدهليزي وسكالا تيمباني على perilymph ، الذي يحتوي على تركيز عال من الصوديوم (138 mM) وتركيز منخفض من البوتاسيوم (6.8 mM) 1. تحتوي وسائط سكالا على اللمف الداخلي ، الذي يحتوي على تركيز عال من البوتاسيوم (154 مللي مول) وتركيز منخفض من الصوديوم (0.91 مللي مول) 1،2،3. يمكن الإشارة إلى هذا الاختلاف في تركيز الأيونات باسم جهد القوقعة الداخلية (EP) ، ويتولد بشكل أساسي عن طريق حركة أيونات البوتاسيوم عبر قنوات أيونية مختلفة وتقاطعات الفجوة في الأوعية الدموية السطورية (SV) على طول الجدار الجانبي للقوقعة4،5،6،7،8،9،10،11. SV هو نسيج غير متجانس شديد الأوعية الدموية يبطن الجانب الإنسي للجدار الجانبي للقوقعة ويحتوي على ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الهامشية والمتوسطة والقاعدية12 (الشكل 1).
ترتبط الخلايا الهامشية عن طريق تقاطعات ضيقة لتشكيل السطح الأكثر وسطية ل SV. يواجه الغشاء القمي اللمف الداخلي لوسط سكالا ويساهم في نقل أيونات البوتاسيوم إلى اللمف الداخلي باستخدام قنوات مختلفة ، بما في ذلك KCNE1 / KCNQ1 و SLC12A2 و Na + -K + -ATPase (NKA) 5،10،13،14. الخلايا الوسيطة هي خلايا مصطبغة تقع بين الخلايا الهامشية والقاعدية وتسهل نقل البوتاسيوم عبر SV باستخدام KCNJ10 (Kir 4.1) 15,16. تقع الخلايا القاعدية على مقربة من الجدار الجانبي للقوقعة وترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الليفية في الرباط الحلزوني لتعزيز إعادة تدوير البوتاسيوم من perilymph12. وقد تورط علم الأمراض من SV في العديد من اضطرابات الأذن17،18. يمكن أن تسبب الطفرات في الجينات المعبر عنها في أنواع خلايا SV الرئيسية ، مثل Kcnq1 و Kcne1 و Kcnj10 و Cldn11 ، الصمم واختلال SV ، بما في ذلك فقدان EP19،20،21،22،23. بالإضافة إلى أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة ، هناك أنواع أخرى من الخلايا أقل دراسة في SV ، مثل خلايا المغزل 22 ، وخلايا الجذر12,24 ، والبلاعم 25 ، والخلايا المحيطة 26 ، والخلايا البطانية 27 ، التي لها أدوار غير محددة بشكل كامل تتضمن التوازن الأيوني وتوليد EP 28.
بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (sNuc-Seq) معلومات حول عدم تجانس الخلية ، بدلا من متوسط mRNA عبر مجموعة من الخلايا29 ، ويمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند دراسة SV30 غير المتجانس. على سبيل المثال ، أنتجت sNuc-Seq تحليلا نسخيا يشير إلى أنه قد يكون هناك دور لخلايا المغزل والجذر في توليد EP وفقدان السمع ومرض Meniere18. يمكن أن يزودنا التوصيف النسخي الإضافي لأنواع خلايا SV المختلفة بمعلومات لا تقدر بثمن حول الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء الآليات والأنواع الفرعية المختلفة لتقلب السمع وفقدان السمع المرتبط ب SV. إن حصاد هياكل الأذن الداخلية الحساسة هذه له أهمية قصوى لتحليل الأنسجة الأمثل.
في هذه الدراسة ، تم وصف نهج التشريح المجهري للوصول إلى السطور الوعائية وعزلها من قوقعة الفئران البالغة من أجل sNuc-Seq أو التلوين المناعي. مطلوب تشريح الفأر البالغ SV لفهم أنواع خلايا SV المختلفة وتوصيف دورها في السمع.
قبل ظهور تسلسل الخلية الواحدة ، استخدم العديد من الباحثين تحليل الأنسجة السائبة ، مما جعل من الممكن فقط تحليل النسخ المتوسط عبر الخلايا. على وجه الخصوص ، جعلت الخلية المفردة و sNuc-Seq من الممكن عزل نسخة خلية واحدة أو نواة واحدة ، على التوالي32. في هذه الحالة ، يمكن تحديد النسخ أحاد…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، NIDCD إلى M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |