Method Article

단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부

DOI:

10.3791/65254

⸱

April 21st, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

In This Article

Summary

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선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.

Abstract

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선조체 혈관에 의해 생성되는 내와우 전위는 적절한 유모 세포 기계 형질도입과 궁극적으로 청력에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 필수적입니다. 선조체 혈관의 병리는 청력 저하를 초래할 수 있습니다. 성인 선조체 혈관의 해부는 집중된 단일 핵 포획 및 후속 단일 핵 시퀀싱 및 면역 염색을 허용합니다. 이러한 기술은 단일 세포 수준에서 선조체 혈관 병태생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

단일 핵 시퀀싱은 선조체 혈관의 전사 분석 설정에 사용할 수 있습니다. 한편, 면역염색은 특정 세포 집단을 식별하는 데 계속 유용합니다. 두 방법 모두 전제 조건으로 적절한 선조체 혈관 박리가 필요하며, 이는 기술적으로 어려울 수 있습니다.

Introduction

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달팽이관은 3개의 유체로 채워진 챔버, 스칼라 현관, 스칼라 중막 및 스칼라 고막으로 구성됩니다. 스칼라 현정과 스칼라 고막은 각각 고농도의 나트륨(138mM)과 낮은 농도의 칼륨(6.8mM)을 함유하고 있는 외림프를 함유하고 있습니다.1. 스칼라 배지는 고농도의 칼륨 (154 mM)과 낮은 농도의 나트륨 (0.91 mM)을 갖는 내 림프를 함유하고 있습니다 1,2,3. 이러한 이온 농도의 차이는 달팽이관 내 전위(EP)라고 할 수 있으며, 주로 달팽이관 4,5,6,7,8,9,10,11의 측벽을 따라 선조체 혈관(SV)의 다양한 이온 채널과 간극 접합부를 통한 칼륨 이온의 이동에 의해 생성됩니다

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Protocol

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모든 동물 실험 및 절차는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 청각 장애 및 기타 의사소통 장애 연구소에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 난청 및 기타 의사소통 장애 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용위원회와 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders)의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 안락사

  1. 체중이 15-20g인 C57BL/6J 또는 Kcnj10-ZsGreen 형질전환 마우스, 출생 후 30+(P30+)를 사용하십시오.
  2. 성인 마우스(P30세 이상)를 승인된 프로토콜(여기서는CO2 질식)을 사용하여 안락사시킨다. 2 차 단계로 참수를 수행하십시오.
    참고: 면역염색의 경우 일부 항체는 SV의 모세혈관에서 혈....

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Results

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본 발명자들은 sNuc-Seq 또는 면역염색에 사용될 SV를 분리하는 방법을 제시한다. SV와 관련된 달팽이관의 관련 해부학적 구조(그림 1)는 사용자가 SV의 조직과 해부 프로토콜의 단계를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

P30 마우스에서 SV의 미세 해부의 각 단계는 관련 비디오에 자세히 설명되어 있으며, 이 SV 해부 및 분리의 주요 단계에 대한 스냅샷이 그림 2에 나와 있습니다.

sNuc-Seq는 이질적인 SV에서 다양한 세포의 전사 프로파일을 조사하는데 유용하다. 이를 시각화할 수 있는 한 가지 방법은 2D UMAP에서 클러스터링하는 것입니다(그림 3). sNuc-Seq에서 생성된 데이터 세트는 다양한 데이터 분석 기술을 사용하여 평가할 수 있으며, .......

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Discussion

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단일 세포 시퀀싱이 등장하기 전에 많은 연구자들은 벌크 조직 분석을 사용하여 세포 전체에 걸쳐 평균화된 전사체만 분석할 수 있었습니다. 특히, single-cell 및 sNuc-Seq는 각각 단일 세포 또는 단일 핵의 전사체를 분리하는 것을 가능하게 하였다32. 이 경우, 단일핵 전사체는 방추 세포(30) 뿐만 아니라 변연, 중간 및 기저 세포에 대해 확인될 수 있다. 이를 통해 SV 세포 유형 간의 전사 이질성을 조사할 수 있으며, 향후 EP의 생성 및 유지를 포함하여 SV 기능에 대한 이러한 세포 유형의 기여도를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. sNuc-Seq를 사용하여 생성된 데이터 세트는 전체 전사 차이에 대한 이해를 용이하게 하고 UMAP 플롯을 사용하여 다양한 세포 집단을 비교하기 위해 차원적으로 축소된 방식으로 표시할 수 있습니다 그림 4. sNuc-Seq 데이터 세트의 해석을.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, NIDCD에서 MH까지 부분적으로 지원되었습니다 (DC000088)

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10-&마이크로; m 필터 (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50010-01sNuc-Seq
18 x 18 mm 커버 유리Fisher Scientific12-541A장착을 위한 커버 슬립
; m filter (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50030-03sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978Z에 SV를 장착하기 위한 Microslide
The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664SV의 중간 세포에서 더 쉽게 볼 수 있는 색소를 가진 범용 마우스 균주.
Cell CounterLogos BiosystemsL20001세포 계수에 사용
Chalizon curette 5'', 크기 3 2.5 mm생물 의학 연구 기기15-1020에 사용
다음 GEM 단일 세포 3' GEM 키트 v3.1크롬PN-1000141단일 세포 3' 유전자 발현 라이브러리
생성 투명 매니큐어Fisher ScientificNC1849418SV 마운트
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dish부 중 표본을 유지하는 데 사용되는Corning08-772B
DAPIInvitrogenD1306, RRID:핵 라벨링에 사용되는 AB_2629482 염색
Dounce 균질화 Sigma-AldrichD8938sNuc-seq
Fine Science Tools11252-30해부용 일반 집게
Dumont #55 집게Fine Science Tools11255-20SV 조작을 더 쉽게 하는 미세한 팁이 있는 집게
태아 소 혈청ThermoFisher16000044sNuc-Seq
접착제 스틱Fisher ScientificNC0691392
GS-IB4 항체분자 장착에 사용 프로브I21411, RRID: AB-2314662모세관 표지에 사용되는 항체
KCNJ10-ZsGreen 마우스n/a/aSV의 중간 세포에서 부분적으로 KCNJ10-ZsGreen을 발현하는 형질전환 마우스.
MgCl2ThermoFisherAM9530GsNuc-Seq
마운팅 시약ThermoFisher#S36940용 마운팅 시약
면역 염색에 사용되는Corning#353047
NaClThermoFisherAAJ216183sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9sNuc-Seq 단계에 사용됨
뉴클레아제 무함유수ThermoFisher 4387936sNuc-Seq
Orbital shakerSilent ShakeSYC-2102A면역 염색 단계에 사용
PBSThermoFisherJ61196. AP면역 염색 및 해부
RNAInvitrogenAM7021sNuc-Seq
ScizzorsFine Science Tools14058-09에 사용됨 마우스 두개골 분할에 사용됨
Tris-HClSigma-Aldrich15506017sNuc-Seq
Trypan 블루 염색Gibco15250061세포 계수에 사용됨
Tween20써모피셔AAJ20605AP sNuc-Seq 단계에 사용됨
Zeiss STEMI SV 11 Apo 실체현미경Zeissn/a해부에 사용되는 현미경
중 필터 조직 SV 30-µ C57BL/6J 마우스 필터 조직 SV 크롬 전송를 밀봉하는 데 사용, 해24웰 배양 접시Dumont #5 겸자에 대한 조직을 균질화하는 데 사용됩니다. 단계에 사용 SV n SV Multiwell 24 웰 플레이트 NaCl 플레이트 단계에 사용 단계에 사용됨 Later 의 SV 보존 단계에 사용됨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences.

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Stria VascularisSingle Nucleus SequencingImmunostainingMouse Inner EarStria Vascularis DissectionCochlear Lateral WallNuclei IsolationConfocal ImagingEndocochlear PotentialHair Cell Mechanotransduction

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