La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.
El potencial endococlear, que es generado por la estría vascular, es esencial para mantener un entorno propicio para la mecanotransducción adecuada de las células ciliadas y, en última instancia, la audición. Las patologías de la estría vascular pueden resultar en una disminución de la audición. La disección de la estría vascular adulta permite la captura focalizada de un solo núcleo y la posterior secuenciación e inmunotinción de un solo núcleo. Estas técnicas se utilizan para estudiar la fisiopatología de la estría vascular a nivel unicelular.
La secuenciación de un solo núcleo se puede utilizar en el contexto del análisis transcripcional de la estría vascular. Mientras tanto, la inmunotinción sigue siendo útil para identificar poblaciones específicas de células. Ambos métodos requieren una disección adecuada de la estría vascular como requisito previo, lo que puede resultar técnicamente desafiante.
La cóclea consiste en tres cámaras llenas de líquido, la scala vestibuli, la scala media y la scala tympani. La scala vestibuli y la scala tympani contienen perilinfa, que tiene una alta concentración de sodio (138 mM) y una baja concentración de potasio (6,8 mM)1. La escala media contiene endolinfa, que tiene una alta concentración de potasio (154 mM) y una baja concentración de sodio (0,91 mM)1,2,3. Esta diferencia en la concentración de iones puede denominarse potencial endococlear (EP), y se genera principalmente por el movimiento de iones de potasio a través de varios canales iónicos y uniones de brecha en la estría vascular (SV) a lo largo de la pared lateral de la cóclea 4,5,6,7,8,9,10,11 . El SV es un tejido heterogéneo, altamente vascularizado, que recubre la cara medial de la pared lateral de la cóclea y contiene tres tipos principales de células: células marginales, intermedias y basales12 (Figura 1).
Las células marginales están conectadas por uniones estrechas para formar la superficie más medial del SV. La membrana apical se enfrenta a la endolinfa de la escala media y contribuye al transporte de iones de potasio en la endolinfa utilizando varios canales, incluyendo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 y Na+-K+-ATPasa (NKA)5,10,13,14. Las células intermedias son células pigmentadas que residen entre las células marginales y basales y facilitan el transporte de potasio a través del SV utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Las células basales se encuentran muy cerca de la pared lateral de la cóclea y están estrechamente asociadas con los fibrocitos del ligamento espiral para promover el reciclaje de potasio de la perilinfa12. La patología de la SV ha sido implicada en numerosos trastornos otológicos17,18. Las mutaciones en los genes expresados en los principales tipos de células SV, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 y Cldn11, pueden causar sordera y disfunción de SV, incluida la pérdida de EP 19,20,21,22,23. Además de los tres tipos principales de células, hay otros tipos de células menos estudiadas en el SV, como las células fusiformes 22, las células raíz12,24, los macrófagos 25, los pericitos 26 y las células endoteliales 27, que tienen funciones incompletamente definidas que involucran la homeostasis iónica y la generación de EP 28.
En comparación con la secuenciación masiva de ARN, la secuenciación de ARN de núcleos únicos (sNuc-Seq) proporciona información sobre la heterogeneidad celular, en lugar de un promedio de ARNm en un grupo de células29, y puede ser particularmente útil cuando se estudia el SV30 heterogéneo. Por ejemplo, sNuc-Seq ha producido un análisis transcripcional que sugiere que puede haber un papel para las células fusiformes y radiculares en la generación de EP, la pérdida de audición y la enfermedad de Meniere18. La caracterización transcripcional adicional de los diversos tipos de células SV puede proporcionarnos información invaluable sobre la fisiopatología subyacente a los diferentes mecanismos y subtipos de fluctuación auditiva relacionada con SV y pérdida auditiva. La cosecha de estas delicadas estructuras del oído interno es de suma importancia para el análisis óptimo del tejido.
En este estudio, se describe el enfoque de microdisección para acceder y aislar la estría vascular de la cóclea de ratón adulta para sNuc-Seq o inmunotinción. La disección del SV del ratón adulto es necesaria para comprender varios tipos de células SV y caracterizar aún más su papel en la audición.
Antes del advenimiento de la secuenciación de células individuales, muchos investigadores utilizaron el análisis de tejido a granel, que solo hizo posible analizar transcriptomas promediados en las células. En particular, la célula única y sNuc-Seq permitieron aislar el transcriptoma de una sola célula o de un solo núcleo, respectivamente32. En este caso, se pueden identificar transcriptomas de un solo núcleo para células marginales, intermedias y basales, así como para células fusifor…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, NIDCD a M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |