الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور
Summary
يتم تقديم العديد من الطرق الشائعة الاستخدام هنا لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء لمستقبلات غشاء البلازما كيناز. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات التفصيلية بما في ذلك تحضير المواد النباتية والمعالجة الدوائية وإعداد التصوير متحد البؤر.
Abstract
في الخلايا حقيقية النواة، تنقل مكونات الغشاء، بما في ذلك البروتينات والليبيدات، زمانيا مكانيا إلى وجهتها داخل نظام الغشاء الداخلي. وهذا يشمل النقل الإفرازي للبروتينات المركبة حديثا إلى سطح الخلية أو خارج الخلية ، والنقل الداخلي للشحنات خارج الخلية أو مكونات غشاء البلازما إلى الخلية ، وإعادة تدوير أو نقل البضائع بين العضيات تحت الخلوية ، إلخ. تعتبر أحداث الاتجار بالأغشية حاسمة في التطور والنمو والتكيف البيئي لجميع الخلايا حقيقية النواة ، وبالتالي فهي تخضع لتنظيم صارم. تخضع كينازات مستقبلات سطح الخلية ، التي تدرك إشارات الرباط من الفضاء خارج الخلية ، لكل من النقل الإفرازي والداخلي. يتم وصف الأساليب الشائعة الاستخدام لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء باستخدام كيناز مستقبلات الليوسين الغنية بالتكرار الموضعي بغشاء البلازما ، ERL1. تشمل الأساليب إعداد المواد النباتية ، والعلاج الدوائي ، وإعداد التصوير متحد البؤر. لمراقبة التنظيم الزماني المكاني ل ERL1 ، تصف هذه الدراسة تحليل التوطين المشترك بين ERL1 وبروتين علامة الجسم متعدد الحويصلات ، RFP-Ara7 ، وتحليل السلاسل الزمنية لهذين البروتينين ، وتحليل z-stack ل ERL1-YFP المعالج بمثبطات الاتجار بالغشاء brefeldin A و wortmannin.
Introduction
حركة مرور الغشاء هي عملية خلوية محفوظة توزع مكونات الغشاء (المعروفة أيضا باسم الشحنات) ، بما في ذلك البروتينات والدهون والمنتجات البيولوجية الأخرى ، بين عضيات مختلفة داخل خلية حقيقية النواة أو عبر غشاء البلازما من وإلى الفضاء خارج الخلية1. يتم تسهيل هذه العملية من خلال مجموعة من الأغشية والعضيات تسمى نظام الغشاء الداخلي ، والذي يتكون من الغشاء النووي ، والشبكة الإندوبلازمية ، وجهاز جولجي ، والفجوة / الجسيمات الحالة ، وغشاء البلازما ، وإندوسوماتمتعددة 1. يتيح نظام الغشاء الداخلي تعديل مكونات الغشاء وتعبئتها ونقلها باستخدام حويصلات ديناميكية تنتقل بين هذه العضيات. تعتبر أحداث الاتجار بالأغشية حاسمة لتطور الخلايا ونموها والتكيف البيئي ، وبالتالي فهي تخضع للائحة صارمة ومعقدة2. حاليا ، تم تطوير مناهج متعددة في البيولوجيا الجزيئية والبيولوجيا الكيميائية والفحص المجهري وقياس الطيف الكتلي وتطبيقها في مجال الاتجار بالأغشية وعززت بشكل كبير فهم التنظيم الزماني المكاني لنظام الغشاء الداخلي 3,4. تستخدم البيولوجيا الجزيئية للتلاعب الجيني الكلاسيكي للاعبين المفترضين المتورطين في الاتجار بالأغشية ، مثل تغيير التعبير الجيني للبروتين محل الاهتمام أو تسمية البروتين محل الاهتمام بعلامات معينة. تشمل الأدوات في البيولوجيا الكيميائية استخدام الجزيئات التي تتداخل على وجه التحديد مع حركة مرور طرق معينة 4,5. يعد قياس الطيف الكتلي قويا لتحديد المكونات في العضية التي تم عزلها ميكانيكيا بواسطة الأساليب الكيميائية الحيوية 3,4. ومع ذلك ، فإن حركة مرور الأغشية هي عملية بيولوجية ديناميكية ومتنوعة ومعقدة1. لتصور عملية الاتجار بالغشاء في الخلايا الحية في ظل ظروف مختلفة ، يعد الفحص المجهري الضوئي أداة أساسية. تم إحراز تقدم مستمر في تقنيات المجهر المتقدمة للتغلب على التحديات في قياس كفاءة وحركية وتنوع الأحداث4. هنا ، تركز هذه الدراسة على المنهجيات المعتمدة على نطاق واسع في البيولوجيا الكيميائية / الدوائية ، والبيولوجيا الجزيئية ، والفحص المجهري لدراسة أحداث الاتجار بالأغشية في نظام مبسط بشكل طبيعي ويمكن الوصول إليه تجريبيا ، وهي عملية تطور الثغور.
الثغور هي مسام دقيقة على الأسطح الهوائية للنبات تفتح وتغلق لتسهيل تبادل الغازات بين الخلايا الداخلية والبيئة6،7،8. ومن ثم، فإن الثغور ضرورية لعملية البناء الضوئي والنتح، وهما حدثان مهمان لبقاء النبات ونموه. يتم ضبط تطور الثغور ديناميكيا من خلال الإشارات البيئية لتحسين تكيف النبات مع البيئة المحيطة9. يعود تاريخ تحديد بروتين المستقبلات Too Many Mouths (TMM) إلى الدراسات التي أجريت في عام 2002 ، وفتح الباب أمام حقبة جديدة من التحقيق في الآليات الجزيئية لتطور الثغور في النبات النموذجي Arabidopsis thaliana10. بعد بضعة عقود فقط ، تم تحديد مسار الإشارات الكلاسيكية. من المنبع إلى المصب ، يتضمن هذا المسار مجموعة من روابط الببتيد الإفرازية في عائلة عوامل نمط البشرة (EFP) ، والعديد من كينازات مستقبلات الليوسين الغنية بالتكرار (LRR) على سطح الخلية في عائلة EREECTA (ER) ، وبروتين مستقبلات LRR TMM ، وشلال MAPK ، والعديد من عوامل النسخ bHLH بما في ذلك SPEECHLESS (SPCH) ، وكتم الصوت ، و FAMA ، والصراخ (SCRM) 11،12،13،14 ، 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. يشير العمل السابق إلى أن أحد كينازات المستقبلات ، ER-LIKE 1 (ERL1) ، يوضح سلوكيات تحت خلوية نشطة عند إدراك EPF20. ينتقل ERL2 أيضا ديناميكيا بين غشاء البلازما وبعض العضيات داخل الخلايا27. يؤدي منع خطوات الاتجار بالغشاء إلى ظهور نقوش ثغورية غير طبيعية ، مما يؤدي إلى مجموعات ثغور على سطح الورقة28. تشير هذه النتائج إلى أن حركة مرور الأغشية تلعب دورا أساسيا في نمو الثغور. تصف هذه الدراسة بروتوكولا للتحقيق الزماني المكاني لديناميكيات ERL1 باستخدام تحليل التوطين المشترك تحت الخلوي للبروتين البروتيني جنبا إلى جنب مع العلاج الدوائي باستخدام بعض مثبطات الاتجار بالغشاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل نظام الغشاء الداخلي سيتوبلازم الخلية الحقيقية النواة إلى مقصورات مختلفة ، مما يتيح الوظيفة الحيوية المتخصصة لهذه العضيات. لتوصيل بروتينات البضائع والجزيئات الكبيرة إلى وجهتها النهائية في الوقت المناسب ، يتم توجيه العديد من الحويصلات للتنقل بين هذه العضيات. تلعب أحداث الاتجار بالأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-2217757) (X.Q.) وجائزة مؤسسة برونسون بجامعة أركنساس للعلوم الطبية (UAMS).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
