Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen
Summary
Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.
Abstract
In eukaryote cellen worden membraancomponenten, waaronder eiwitten en lipiden, spatiotemporaal getransporteerd naar hun bestemming binnen het endomembrane systeem. Dit omvat het secretoire transport van nieuw gesynthetiseerde eiwitten naar het celoppervlak of de buitenkant van de cel, het endocytische transport van extracellulaire ladingen of plasmamembraancomponenten in de cel, en het recyclen of afsluiten van ladingen tussen de subcellulaire organellen, enz. Membraanhandel is cruciaal voor de ontwikkeling, groei en aanpassing van het milieu van alle eukaryote cellen en staat dus onder strenge regelgeving. Celoppervlakreceptorkinasen, die ligandsignalen uit de extracellulaire ruimte waarnemen, ondergaan zowel secretoir als endocytisch transport. Veelgebruikte benaderingen om de membraanhandelgebeurtenissen te bestuderen met behulp van een plasmamembraan-gelokaliseerd leucine-rich-repeat receptorkinase, ERL1, worden hier beschreven. De benaderingen omvatten de bereiding van plantmateriaal, farmacologische behandeling en confocale beeldvorming. Om de spatiotemporale regulatie van ERL1 te monitoren, beschrijft deze studie de co-lokalisatieanalyse tussen ERL1 en een multi-vesiculair lichaamsmarkereiwit, RFP-Ara7, de tijdreeksanalyse van deze twee eiwitten en de z-stackanalyse van ERL1-YFP behandeld met de membraanhandelremmers brefeldine A en wortmannine.
Introduction
Membraanverkeer is een geconserveerd cellulair proces dat membraancomponenten (ook bekend als ladingen), waaronder eiwitten, lipiden en andere biologische producten, verdeelt tussen verschillende organellen binnen een eukaryote cel of over het plasmamembraan van en naar de extracellulaire ruimte1. Dit proces wordt vergemakkelijkt door een verzameling membranen en organellen genaamd het endomembrane systeem, dat bestaat uit het kernmembraan, het endoplasmatisch reticulum, het Golgi-apparaat, de vacuole / lysosomen, het plasmamembraan en meerdere endosomen1. Het endomembrane systeem maakt de modificatie, verpakking en transport van membraancomponenten mogelijk met behulp van dynamische blaasjes die tussen deze organellen pendelen. Membraanhandel is cruciaal voor celontwikkeling, groei en aanpassing aan het milieu en valt dus onder strenge en complexe regelgeving2. Momenteel zijn meerdere benaderingen in de moleculaire biologie, chemische biologie, microscopie en massaspectrometrie ontwikkeld en toegepast op het gebied van membraanhandel en hebben ze het begrip van de spatiotemporale regulatie van het endomembrane systeem aanzienlijk verbeterd 3,4. Moleculaire biologie wordt gebruikt voor klassieke genetische manipulaties van de vermeende spelers die betrokken zijn bij membraanhandel, zoals het veranderen van de genexpressie van het eiwit van belang of het labelen van het eiwit van belang met bepaalde tags. Hulpmiddelen in de chemische biologie omvatten het gebruik van moleculen die specifiek interfereren met het verkeer van bepaalde routes 4,5. Massaspectrometrie is krachtig voor het identificeren van de componenten in een organel dat mechanisch is geïsoleerd door biochemische benaderingen 3,4. Membraanverkeer is echter een dynamisch, divers en complex biologisch proces1. Om het membraantransportproces in levende cellen onder verschillende omstandigheden te visualiseren, is lichtmicroscopie een essentieel hulpmiddel. Er is voortdurend vooruitgang geboekt in geavanceerde microscooptechnieken om de uitdagingen bij het meten van de efficiëntie, kinetiek en diversiteit van de gebeurtenissen te overwinnen4. Hier richt deze studie zich op de algemeen aanvaarde methodologieën in de chemische / farmacologische biologie, moleculaire biologie en microscopie om membraanhandelgebeurtenissen te bestuderen in een natuurlijk vereenvoudigd en experimenteel toegankelijk systeem, het stomatale ontwikkelingsproces.
Huidmondjes zijn microporiën op de luchtoppervlakken van planten die open en dicht gaan om de gasuitwisseling tussen de binnenste cellen en de omgeving te vergemakkelijken 6,7,8. Daarom zijn huidmondjes essentieel voor fotosynthese en transpiratie, twee gebeurtenissen die cruciaal zijn voor de overleving en groei van planten. De ontwikkeling van het stomatale wordt dynamisch aangepast door omgevingssignalen om de aanpassing van de plant aan de omgeving te optimaliseren9. Daterend uit studies in 2002, opende de identificatie van het receptoreiwit Too Many Mouths (TMM) de deur naar een nieuw tijdperk van onderzoek naar de moleculaire mechanismen van stomatale ontwikkeling in de modelplant Arabidopsis thaliana10. Al na enkele decennia is een klassieke signaleringsroute geïdentificeerd. Van stroomopwaarts naar stroomafwaarts omvat deze route een groep secretoire peptideliganden in de epidermale patroonfactoren (EFP) familie, verschillende celoppervlak leucine-rich-repeat (LRR) receptorkinasen in de EREECTA (ER) familie, het LRR-receptoreiwit TMM, een MAPK-cascade en verschillende bHLH-transcriptiefactoren, waaronder SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA en SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Eerder werk geeft aan dat een van de receptorkinasen, ER-LIKE 1 (ERL1), actief subcellulair gedrag vertoont bij EPF-perceptie20. ERL2 verkeert ook dynamisch tussen het plasmamembraan en sommige intracellulaire organellen27. Het blokkeren van de membraanhandelstappen veroorzaakt abnormale stomatale patronen, resulterend in stomatale clusters op het bladoppervlak28. Deze resultaten suggereren dat membraanverkeer een essentiële rol speelt in de stomatale ontwikkeling. Deze studie beschrijft een protocol om spatiotemporaal de ERL1-dynamiek te onderzoeken met behulp van eiwit-eiwit subcellulaire co-lokalisatieanalyse in combinatie met farmacologische behandeling met behulp van enkele membraanhandelremmers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het endomembrane systeem scheidt het cytoplasma van een eukaryote cel in verschillende compartimenten, wat de gespecialiseerde biologische functie van deze organellen mogelijk maakt. Om ladingeiwitten en macromoleculen op het juiste moment op hun eindbestemming af te leveren, worden tal van blaasjes geleid om tussen deze organellen te pendelen. Sterk gereguleerde membraanhandelgebeurtenissen spelen een fundamentele rol in de levensvatbaarheid, ontwikkeling en groei van cellen. Het mechanisme dat dit cruciale en gecomplic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) en de University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
