स्टोमेटा वंश कोशिकाओं में झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए छवि-आधारित तरीके
Summary
प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर काइनेज की झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए यहां कई आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके पेश किए गए हैं। यह पांडुलिपि पौधे सामग्री की तैयारी, औषधीय उपचार और कॉन्फोकल इमेजिंग सेटअप सहित विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।
Abstract
यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रोटीन और लिपिड सहित झिल्ली घटकों को एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम के भीतर उनके गंतव्य तक पहुंचाया जाता है। इसमें कोशिका की सतह या कोशिका के बाहर नए संश्लेषित प्रोटीन का स्रावी परिवहन, कोशिका में बाह्य कार्गो या प्लाज्मा झिल्ली घटकों का एंडोसाइटिक परिवहन और उपकोशिकीय जीवों के बीच कार्गो का पुनर्चक्रण या शटलिंग परिवहन आदि शामिल हैं। झिल्ली तस्करी की घटनाएं सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं के विकास, विकास और पर्यावरणीय अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार, कड़े विनियमन के अधीन हैं। सेल-सतह रिसेप्टर किनेसेस, जो बाह्य अंतरिक्ष से लिगैंड संकेतों का अनुभव करते हैं, स्रावी और एंडोसाइटिक परिवहन दोनों से गुजरते हैं। प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत ल्यूसीन-समृद्ध-रिपीट रिसेप्टर काइनेज, ईआरएल 1 का उपयोग करके झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण यहां वर्णित हैं। दृष्टिकोण में पौधे सामग्री की तैयारी, औषधीय उपचार और कॉन्फोकल इमेजिंग सेटअप शामिल हैं। ईआरएल 1 के स्थानिक विनियमन की निगरानी के लिए, यह अध्ययन ईआरएल 1 और एक बहु-वेसिकुलर बॉडी मार्कर प्रोटीन, आरएफपी-आरा 7, इन दो प्रोटीनों के समय श्रृंखला विश्लेषण और ईआरएल 1-वाईएफपी के जेड-स्टैक विश्लेषण के बीच सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का वर्णन करता है।
Introduction
झिल्ली यातायात एक संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया है जो प्रोटीन, लिपिड और अन्य जैविक उत्पादों सहित झिल्ली घटकों (जिसे कार्गो के रूप में भी जाना जाता है) को एक यूकेरियोटिक कोशिका के भीतर या प्लाज्मा झिल्ली के पार विभिन्न जीवों के बीच वितरित करताहै। इस प्रक्रिया को एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम नामक झिल्ली और ऑर्गेनेल के संग्रह द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है, जिसमें परमाणु झिल्ली, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोल्गी तंत्र, रिक्तिका / लाइसोसोम, प्लाज्मा झिल्ली और कई एंडोसोम1 होते हैं। एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम गतिशील पुटिकाओं का उपयोग करके झिल्ली घटकों के संशोधन, पैकेजिंग और परिवहन को सक्षम बनाता है जो इन ऑर्गेनेल के बीच शटल करते हैं। झिल्ली तस्करी की घटनाएं कोशिका विकास, विकास और पर्यावरणीय अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार, कठोर और जटिल विनियमन2 के तहत हैं। वर्तमान में, आणविक जीव विज्ञान, रासायनिक जीव विज्ञान, माइक्रोस्कोपी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और झिल्ली तस्करी के क्षेत्र में लागू किए गए हैं और एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम 3,4 के स्थानिक विनियमन की समझ को बहुत उन्नत किया है। आणविक जीव विज्ञान का उपयोग झिल्ली तस्करी में शामिल कथित खिलाड़ियों के शास्त्रीय आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए किया जाता है, जैसे कि रुचि के प्रोटीन की जीन अभिव्यक्ति को बदलना या कुछ टैग के साथ रुचि के प्रोटीन को लेबल करना। रासायनिक जीव विज्ञान में उपकरणों में अणुओं का उपयोग शामिल है जो विशेष रूप से कुछ मार्गों 4,5 के यातायात में हस्तक्षेप करते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक ऑर्गेनेल में घटकों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली है जिसे जैव रासायनिक दृष्टिकोण 3,4 द्वारा यांत्रिक रूप से अलग किया गया है। हालांकि, झिल्ली यातायात एक गतिशील, विविध और जटिल जैविक प्रक्रियाहै। विभिन्न परिस्थितियों में जीवित कोशिकाओं में झिल्ली तस्करी प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक आवश्यक उपकरण है। घटनाओं की दक्षता, कैनेटीक्स और विविधता को मापने में चुनौतियों को दूर करने के लिए उन्नत माइक्रोस्कोप तकनीकों में निरंतर प्रगति की गई है। फार्माकोलॉजिकल जीव विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान और माइक्रोस्कोपी में व्यापक रूप से अपनाई गई पद्धतियों पर ध्यान केंद्रित किया गया है ताकि प्राकृतिक रूप से सरलीकृत और प्रयोगात्मक रूप से सुलभ प्रणाली, स्टोमेटा विकास प्रक्रिया में झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन किया जा सके।
स्टोमेटा पौधे की हवाई सतहों पर सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो आंतरिक कोशिकाओं और पर्यावरण 6,7,8 के बीच गैस विनिमय की सुविधा के लिए खुलते और बंद होते हैं। इसलिए, प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन के लिए स्टोमेटा आवश्यक हैं, दो घटनाएं जो पौधे के अस्तित्व और विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्टोमेटा विकास को पर्यावरण संकेतों द्वारा गतिशील रूप से समायोजित किया जाता है ताकि परिवेश 9 के लिए पौधे के अनुकूलन को अनुकूलित किया जासके। 2002 में किए गए अध्ययनों में, रिसेप्टर प्रोटीन टू मैनी माउथ्स (टीएमएम) की पहचान ने मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना10 में स्टोमेटा विकास के आणविक तंत्र की जांच के एक नए युग के लिए दरवाजा खोल दिया। कुछ ही दशकों के बाद, एक शास्त्रीय सिग्नलिंग मार्ग की पहचान की गई है। अपस्ट्रीम से डाउनस्ट्रीम तक, इस मार्ग में एपिडर्मल पैटर्निंग फैक्टर्स (ईएफपी) परिवार में स्रावी पेप्टाइड लिगेंड का एक समूह, ईआरईसीटीए (ईआर) परिवार में कई सेल-सतह ल्यूसीन-रिच-रिपीट (एलआरआर) रिसेप्टर किनेसेस, एलआरआर रिसेप्टर प्रोटीन टीएमएम, एक एमएपीकैस्केड, और कई बीएचएलएच ट्रांसक्रिप्शन कारक शामिल हैं, जिनमें निशब्द (एसपीसीएच), म्यूट, एफएएमए, और स्क्रीम (एससीआरएम) 11,12,13,14 शामिल हैं। 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. पिछला काम इंगित करता है कि रिसेप्टर किनेसेस में से एक, ईआर-लाइक 1 (ईआरएल 1), ईपीएफ धारणा20 पर सक्रिय उपकोशिकीय व्यवहार प्रदर्शित करता है। ईआरएल 2 भी गतिशील रूप से प्लाज्मा झिल्ली और कुछ इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल27 के बीच यातायात करता है। झिल्ली तस्करी चरणों को अवरुद्ध करने से असामान्य स्टोमेटा पैटर्निंग होती है, जिसके परिणामस्वरूप पत्तीकी सतह पर स्टोमेटा क्लस्टर होते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि झिल्ली यातायात रंध्र के विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। यह अध्ययन कुछ झिल्ली तस्करी अवरोधकों का उपयोग करके औषधीय उपचार के साथ संयुक्त प्रोटीन-प्रोटीन उपकोशिकीय सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का उपयोग करके ईआरएल 1 गतिशीलता की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम एक यूकेरियोटिक कोशिका के साइटोप्लाज्म को विभिन्न डिब्बों में अलग करता है, जो इन ऑर्गेनेल के विशेष जैविक कार्य को सक्षम बनाता है। कार्गो प्रोटीन और मैक्रोमोलेक्यूल्स को सही समय ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (आईओएस -2217757) (एक्सक्यू) और यूनिवर्सिटी ऑफ अर्कांसस फॉर मेडिकल साइंसेज (यूएएमएस) ब्रोंसन फाउंडेशन अवार्ड (एचजेड) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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