気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法
Summary
ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。
Abstract
真核細胞では、タンパク質や脂質などの膜成分が膜内システム内の目的地に時空間的に輸送されます。これには、新たに合成されたタンパク質の細胞表面または細胞外への分泌輸送、細胞外または原形質膜成分の細胞内細胞輸送、および細胞内オルガネラ間の貨物のリサイクルまたは往復輸送などが含まれます。膜輸送イベントは、すべての真核細胞の発生、成長、および環境適応にとって重要であるため、厳しい規制下にあります。細胞外空間からのリガンドシグナルを知覚する細胞表面受容体キナーゼは、分泌輸送とエンドサイトーシス輸送の両方を受けます。ここでは、原形質膜に局在するロイシンリッチリピート受容体キナーゼERL1を使用して膜輸送イベントを研究するために一般的に使用されるアプローチについて説明します。アプローチには、植物材料の調製、薬理学的処理、および共焦点イメージングのセットアップが含まれます。ERL1の時空間制御を監視するために、本研究では、ERL1と多胞体マーカータンパク質RFP-Ara7との共局在解析、これら2つのタンパク質の時系列解析、および膜輸送阻害剤であるブレフェルジンAとワートマニンで処理したERL1-YFPのzスタック解析について説明します。
Introduction
膜輸送は、タンパク質、脂質、その他の生物学的産物を含む膜成分(貨物とも呼ばれる)を、真核細胞内の異なる細胞小器官間または原形質膜を横切って細胞外空間との間で分配する保存された細胞プロセスです1。このプロセスは、核膜、小胞体、ゴルジ体、液胞/リソソーム、原形質膜、および複数のエンドソームで構成される膜内システムと呼ばれる膜と細胞小器官の集まりによって促進されます1。膜内システムは、これらの細胞小器官間を往復する動的小胞を使用して、膜成分の修飾、パッケージング、および輸送を可能にします。膜輸送イベントは、細胞の発生、成長、および環境適応に不可欠であるため、厳格で複雑な規制下にあります2。現在、分子生物学、ケミカルバイオロジー、顕微鏡、質量分析における複数のアプローチが開発され、膜輸送の分野に適用されており、膜内システムの時空間調節の理解を大幅に進めています3,4。分子生物学は、目的のタンパク質の遺伝子発現を変更したり、目的のタンパク質を特定のタグで標識したりするなど、膜輸送に関与する推定プレーヤーの古典的な遺伝子操作に使用されます。ケミカルバイオロジーのツールには、特定のルート4,5の交通を特に妨害する分子の使用が含まれます。質量分析は、生化学的アプローチによって機械的に単離された細胞小器官の成分を同定するのに強力です3,4。しかし、膜の交通は動的で多様で複雑な生物学的プロセスです1。さまざまな条件下で生細胞における膜輸送プロセスを可視化するには、光学顕微鏡法が不可欠なツールです。イベントの効率、動力学、および多様性を測定する際の課題を克服するために、高度な顕微鏡技術が継続的に進歩しています4。ここでは、化学/薬理生物学、分子生物学、および顕微鏡法で広く採用されている方法論に焦点を当て、自然に単純化され実験的にアクセス可能なシステムである気孔発生プロセスにおける膜輸送イベントを研究します。
気孔は、植物の空中表面上の微細孔であり、内部細胞と環境との間のガス交換を容易にするために開閉する6,7,8。したがって、気孔は光合成と蒸散に不可欠であり、植物の生存と成長に不可欠な2つのイベントです。気孔の発達は、環境の合図によって動的に調整され、植物の周囲への適応を最適化します9。2002年の研究にさかのぼり、受容体タンパク質Too Many Mouths(TMM)の同定は、モデル植物シロイヌナズナ10における気孔発生の分子メカニズムを調査する新しい時代への扉を開きました。わずか数十年後、古典的なシグナル伝達経路が同定されました。上流から下流まで、この経路には、表皮パターニング因子(EFP)ファミリーの分泌ペプチドリガンド群、EREETA(ER)ファミリーのいくつかの細胞表面ロイシンリッチリピート(LRR)受容体キナーゼ、LRR受容体タンパク質TMM、MAPKカスケード、およびスピーチレス(SPCH)、MUTE、FAMA、およびSCREAM(SCRM)11,12,13,14を含むいくつかのbHLH転写因子が含まれます 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26。以前の研究では、受容体キナーゼの1つであるER-LIKE 1(ERL1)が、EPF知覚時に活発な細胞内挙動を示すことが示されています20。ERL2はまた、原形質膜といくつかの細胞内オルガネラとの間の動的に輸送する27。膜輸送ステップを遮断すると、異常な気孔パターニングが生じ、葉表面28上に気孔クラスターが生じる。これらの結果は、膜交通が気孔の発達に不可欠な役割を果たしていることを示唆しています。本研究では、タンパク質間細胞内共局在解析と膜輸送阻害剤を用いた薬理学的治療を組み合わせて、ERL1動態を時空間的に調べるためのプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
膜内システムは、真核細胞の細胞質を異なる区画に分離し、これらの細胞小器官の特殊な生物学的機能を可能にします。貨物タンパク質と高分子を適切なタイミングで最終目的地に送達するために、多数の小胞がこれらの細胞小器官間を往復するように誘導されます。高度に制御された膜輸送イベントは、細胞の生存率、発生、および成長において基本的な役割を果たします。この重要で複?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団(IOS-2217757)(X.Q.)およびアーカンソー医科大学(UAMS)ブロンソン財団賞(H.Z.)の支援を受けました。
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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