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생물학

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65257
, ,
1Department of Biology,Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department,University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

진핵 세포에서 단백질과 지질을 포함한 막 구성 요소는 내막 시스템 내에서 시공간적으로 목적지로 운반됩니다. 여기에는 새로 합성된 단백질을 세포 표면 또는 세포 외부로 분비 수송하는 것, 세포외 화물 또는 원형질막 성분을 세포로 세포내로 운반하는 것, 세포내 소기관 사이에서 화물을 재활용하거나 이동하는 것 등이 포함됩니다. 막 밀매 사건은 모든 진핵 세포의 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격한 규제를 받고 있습니다. 세포외 공간에서 리간드 신호를 감지하는 세포 표면 수용체 키나아제는 분비 및 세포내 수송을 모두 거칩니다. 원형질막-국소화된 류신-풍부한-반복 수용체 키나아제, ERL1을 사용하여 막 트래피킹 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법이 여기에 기재되어 있다. 접근 방식에는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정이 포함됩니다. ERL1의 시공간 조절을 모니터링하기 위해 이 연구에서는 ERL1과 다소포체 마커 단백질인 RFP-Ara7 사이의 공동 국소화 분석, 이 두 단백질의 시계열 분석, 막 밀매 억제제 brefeldin A 및 wortmannin으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 분석에 대해 설명합니다.

Introduction

막 이동(Membrane traffic)은 단백질, 지질 및 기타 생물학적 산물을 포함한 막 구성 요소(화물이라고도 함)를 진핵 세포 내의 서로 다른 세포 기관 사이 또는 원형질막을 가로질러 세포외 공간으로 또는 세포외 공간으로 분배하는 보존된 세포 과정입니다1. 이 과정은 핵막, 소포체, 골지체, 액포/리소좀, 원형질막 및 다중 엔도솜으로 구성된 내막 시스템(endomembrane system)이라는 막과 세포 기관의 집합체에 의해 촉진된다1. 내막 시스템은 이러한 세포 기관 사이를 왕복하는 동적 소포를 사용하여 막 구성 요소의 수정, 포장 및 운송을 가능하게 합니다. 세포막 밀매 현상은 세포 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격하고 복잡한 규제를 받고 있습니다2. 현재, 분자 생물학, 화학 생물학, 현미경 및 질량 분석법의 여러 접근법이 개발되어 막 이동 분야에 적용되었으며 내막 시스템 3,4의 시공간 조절에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 분자 생물학은 관심 단백질의 유전자 발현을 변경하거나 관심 단백질에 특정 태그를 표시하는 것과 같이 막 이동에 관여하는 것으로 추정되는 플레이어의 고전적인 유전자 조작에 사용됩니다. 화학 생물학의 도구에는 특정 경로의 교통을 구체적으로 방해하는 분자의 사용이 포함됩니다 4,5. 질량 분석법은 생화학적 접근법 3,4에 의해 기계적으로 분리된 세포 기관의 구성 요소를 식별하는 데 강력합니다. 그러나 막 교통은 역동적이고 다양하며 복잡한 생물학적 과정이다1. 다양한 조건에서 살아있는 세포의 막 이동 과정을 시각화하기 위해서는 광학 현미경이 필수적인 도구입니다. 사건의 효율성, 동역학 및 다양성을 측정하는 문제를 극복하기 위해 첨단 현미경 기술이 지속적으로 발전해 왔습니다4. 여기에서 이 연구는 화학/약리학 생물학, 분자 생물학 및 현미경 검사에서 널리 채택된 방법론에 중점을 두어 자연적으로 단순화되고 실험적으로 접근 가능한 시스템인 기공 발달 과정에서 막 이동 사건을 연구합니다.

기공은 내부 세포와 환경사이의 가스 교환을 촉진하기 위해 열리고 닫히는 식물 공중 표면의 미세 기공입니다 6,7,8. 따라서 기공은 식물의 생존과 성장에 중요한 두 가지 사건인 광합성과 증산에 필수적입니다. 기공 발달은 주변 환경에 대한 식물의 적응을 최적화하기 위해 환경 신호에 의해 동적으로 조정된다9. 2002년 연구로 거슬러 올라가면, 수용체 단백질인 TMM(Too Many Mouths)의 식별은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana10에서 기공 발달의 분자 메커니즘을 조사하는 새로운 시대의 문을 열었습니다. 불과 수십 년 후, 고전적인 신호 전달 경로가 확인되었습니다. 상류에서 하류로, 이 경로는 표피 패턴 인자 (EFP) 패밀리의 분비 펩티드 리간드 그룹, EREECTA (ER) 패밀리의 여러 세포 표면 류신 풍부 반복 (LRR) 수용체 키나아제, LRR 수용체 단백질 TMM, MAPK 캐스케이드 및 SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA 및 SCREAM (SCRM)을 포함한 여러 bHLH 전사 인자를 포함합니다11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. 이전 연구는 수용체 키나아제 중 하나인 ER-LIKE 1(ERL1)이 EPF 인식 시 활성 세포내 행동을 나타낸다는 것을 나타냅니다 20. ERL2는 또한 원형질막과 일부 세포내 소기관 사이를 동적으로 이동한다27. 막 트래피킹 단계를 차단하는 것은 비정상적인 기공 패터닝을 일으켜 잎 표면에 기공 클러스터를 생성한다(28). 이러한 결과는 막 교통량이 기공 발달에 필수적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 일부 막 이동 억제제를 사용한 약리학적 치료와 결합된 단백질-단백질 세포 내 공동 국소화 분석을 사용하여 ERL1 역학을 시공간적으로 조사하는 프로토콜을 설명합니다.

Protocol

1. 용액 준비 표백제 15mL와 증류수 35mL 및 Triton X-100 50μL를 혼합하여 종자 살균 용액을 준비합니다. BFA 분말을 에탄올에 용해시켜 브레펠딘 A(BFA) 용액을 최종 농도 10 mM(스톡)으로 제조한다. Wm 분말을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM(stock)이 되도록 맥아즙만닌(Wm) 용액을 제조한다. 2. 씨앗 파종 필요한 형질전환 식물 각각에서 10…

Representative Results

이전 연구에서는 ERL1이 동적 막 트래피킹 사건을 겪는 활성 수용체 키나아제임을 나타냈다20. ERL1은 원형질막의 막횡단 LRR-수용체 키나아제입니다. 소포체에서 새로 합성된 ERL1은 골지체에서 처리되어 원형질막으로 추가로 운반됩니다. 원형질막 상의 ERL1 분자는 그의 세포외 LRR 도메인18을 사용하여 EPF 리간드를 인지할 수 있다. EPF1을 포함한 억제성 EPF에 의해 ?…

Discussion

내막 시스템은 진핵 세포의 세포질을 서로 다른 구획으로 분리하여 이러한 세포 기관의 특수한 생물학적 기능을 가능하게 합니다. 화물 단백질과 거대분자를 적시에 최종 목적지로 전달하기 위해 수많은 소포가 이러한 세포 기관 사이를 왕복하도록 안내됩니다. 고도로 조절된 막 밀매 사건은 세포의 생존력, 발달 및 성장에 근본적인 역할을 합니다. 이 중요하고 복잡한 과정을 조절하는 메커니즘…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 National Science Foundation(IOS-2217757)(XQ)과 University of Arkansas for Medical Sciences(UAMS) Bronson Foundation Award(H.Z.)의 지원을 받았습니다.

Materials

10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug
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References

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He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).
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