Bildebaserte metoder for å studere membrantrafikkhendelser i stomatale avstamningsceller

Summary

Flere vanlige metoder introduseres her for å studere membrantrafikkhendelsene til en plasmamembranreseptorkinase. Dette manuskriptet beskriver detaljerte protokoller, inkludert forberedelse av plantemateriale, farmakologisk behandling og konfokal bildeoppsett.

Abstract

I eukaryote celler transporteres membrankomponenter, inkludert proteiner og lipider, spatiotemporalt til deres destinasjon i endomembransystemet. Dette inkluderer sekretorisk transport av nylig syntetiserte proteiner til celleoverflaten eller utsiden av cellen, endocytisk transport av ekstracellulære laster eller plasmamembrankomponenter inn i cellen, og resirkulering eller skytteltransport av last mellom de subcellulære organellene, etc. Membrantrafikkhendelser er avgjørende for utvikling, vekst og miljøtilpasning av alle eukaryote celler og er derfor under streng regulering. Celleoverflatereseptorkinaser, som oppfatter ligandsignaler fra det ekstracellulære rommet, gjennomgår både sekretorisk og endocytisk transport. Vanlige tilnærminger for å studere membrantrafikkhendelser ved bruk av en plasmamembranlokalisert leucinrik-repetisjonsreseptorkinase, ERL1, er beskrevet her. Tilnærmingene inkluderer forberedelse av plantemateriale, farmakologisk behandling og konfokal bildeoppsett. For å overvåke den spatiotemporale reguleringen av ERL1, beskriver denne studien samlokaliseringsanalysen mellom ERL1 og et multivesikulært kroppsmarkørprotein, RFP-Ara7, tidsserieanalysen av disse to proteinene og z-stack-analysen av ERL1-YFP behandlet med membrantrafikkhemmerne brefeldin A og wortmannin.

Introduction

Membrantrafikk er en konservert cellulær prosess som distribuerer membrankomponenter (også kjent som laster), inkludert proteiner, lipider og andre biologiske produkter, mellom forskjellige organeller i en eukaryot celle eller over plasmamembranen til og fra det ekstracellulære rommet¹. Denne prosessen forenkles av en samling membraner og organeller kalt endomembransystemet, som består av kjernemembranen, endoplasmatisk retikulum, Golgi-apparatet, vakuol / lysosomer, plasmamembranen og flere endosomer¹. Endomembransystemet muliggjør modifikasjon, pakking og transport av membrankomponenter ved hjelp av dynamiske vesikler som skyttelbuss mellom disse organellene. Membrantrafikkhendelser er avgjørende for celleutvikling, vekst og miljøtilpasning og er derfor under streng og kompleks regulering². For tiden har flere tilnærminger innen molekylærbiologi, kjemisk biologi, mikroskopi og massespektrometri blitt utviklet og anvendt på feltet membranhandel og har i stor grad avansert forståelsen av den spatiotemporale reguleringen av endomembransystemet ^3,4. Molekylærbiologi brukes til klassiske genetiske manipulasjoner av de antatte aktørene som er involvert i membranhandel, for eksempel å endre genuttrykket av proteinet av interesse eller merke proteinet av interesse med visse koder. Verktøy i kjemisk biologi inkluderer bruk av molekyler som spesifikt forstyrrer trafikken på visse ruter ^4,5. Massespektrometri er kraftig for å identifisere komponentene i en organell som har blitt mekanisk isolert ved biokjemiske tilnærminger ^3,4. Imidlertid er membrantrafikk en dynamisk, mangfoldig og kompleks biologisk prosess¹. For å visualisere membrantrafikkprosessen i levende celler under forskjellige forhold, er lysmikroskopi et viktig verktøy. Kontinuerlig fremgang har blitt gjort i avanserte mikroskopteknikker for å overvinne utfordringene med å måle effektiviteten, kinetikken og mangfoldet av hendelsene⁴. Her fokuserer denne studien på de allment vedtatte metodene innen kjemisk / farmakologisk biologi, molekylærbiologi og mikroskopi for å studere membrantrafikkhendelser i et naturlig forenklet og eksperimentelt tilgjengelig system, den stomatale utviklingsprosessen.

Stomata er mikroporer på planteoverflater som åpnes og lukkes for å lette gassutveksling mellom de indre cellene og miljøet ^6,7,8. Derfor er stomata avgjørende for fotosyntese og transpirasjon, to hendelser som er avgjørende for planteoverlevelse og vekst. Stomatal utvikling justeres dynamisk av miljømessige signaler for å optimalisere plantens tilpasning til omgivelsene⁹. Dateres tilbake til studier i 2002, åpnet identifiseringen av reseptorproteinet Too Many Mouths (TMM) døren til en ny æra for å undersøke molekylære mekanismer for stomatal utvikling i modellplanten Arabidopsis thaliana¹⁰. Etter bare noen tiår er en klassisk signalvei identifisert. Fra oppstrøms til nedstrøms inkluderer denne banen en gruppe sekretoriske peptidligander i familien epidermale mønsterfaktorer (EFP), flere celleoverflate leucinrike-gjentatte (LRR) reseptorkinaser i EREECTA (ER) -familien, LRR-reseptorproteinet TMM, en MAPK-kaskade og flere bHLH-transkripsjonsfaktorer, inkludert SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA og SCREAM (SCRM) ^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Tidligere arbeid indikerer at en av reseptorkinasene, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrerer aktiv subcellulær atferd ved EPF-oppfatning²⁰. ERL2 trafikkerer også dynamisk mellom plasmamembranen og noen intracellulære organeller²⁷. Blokkering av membrantrafikktrinnene forårsaker unormal stomatal mønster, noe som resulterer i stomatale klynger på bladoverflaten²⁸. Disse resultatene tyder på at membrantrafikk spiller en viktig rolle i stomatal utvikling. Denne studien beskriver en protokoll for å spatiotemporalt undersøke ERL1-dynamikken ved hjelp av protein-protein subcellulær samlokaliseringsanalyse kombinert med farmakologisk behandling ved bruk av noen membrantrafikkhemmere.

Protocol

1. Forberedelse av løsningene Forbered frøsteriliseringsløsning ved å blande 15 ml blekemiddel med 35 ml destillert vann og 50 μl Triton X-100. Forbered brefeldin A (BFA) oppløsning ved å oppløse BFA-pulveret i etanol til en endelig konsentrasjon på 10 mM (lager). Forbered wortmannin (Wm) oppløsning ved å oppløse Wm-pulveret i DMSO til en endelig konsentrasjon på 10 mM (stam). 2. Såing av frøene Aliquot 10-50 …

Representative Results

En tidligere studie indikerte at ERL1 er en aktiv reseptorkinase som gjennomgår dynamiske membrantrafikkhendelser20. ERL1 er en transmembran LRR-reseptorkinase på plasmamembranen. Nylig syntetisert ERL1 i endoplasmatisk retikulum behandles i Golgi-legemene og transporteres videre til plasmamembranen. ERL1-molekylene på plasmamembranen kan oppfatte EPF-ligander ved å bruke deres ekstracellulære LRR-domene18. Ved aktivering av de hemmende EPFene, inkludert EPF1, blir ERL…

Discussion

Endomembransystemet separerer cytoplasma av en eukaryot celle i forskjellige rom, noe som muliggjør den spesialiserte biologiske funksjonen til disse organellene. For å levere lastproteiner og makromolekyler til deres endelige destinasjon til rett tid, blir mange vesikler guidet til skyttelbuss mellom disse organellene. Sterkt regulerte membrantrafikkhendelser spiller grunnleggende roller i levedyktighet, utvikling og vekst av celler. Mekanismen som regulerer denne avgjørende og kompliserte prosessen er fortsatt dårl…

Materials

10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug