Bildbaserade metoder för att studera membransmugglingshändelser i stomatala härstamningsceller

Summary

Flera vanliga metoder introduceras här för att studera membranhandelshändelserna hos ett plasmamembranreceptorkinas. Detta manuskript beskriver detaljerade protokoll inklusive beredning av växtmaterial, farmakologisk behandling och konfokal bildinställning.

Abstract

I eukaryota celler transporteras membrankomponenter, inklusive proteiner och lipider, spatiotemporalt till sin destination inom endomembransystemet. Detta inkluderar sekretorisk transport av nyligen syntetiserade proteiner till cellytan eller utsidan av cellen, endocytisk transport av extracellulära laster eller plasmamembrankomponenter in i cellen och återvinning eller shuttling transport av laster mellan de subcellulära organellerna etc. Membranhandelshändelser är avgörande för utveckling, tillväxt och miljöanpassning av alla eukaryota celler och är därför under sträng reglering. Cellytereceptorkinaser, som uppfattar ligandsignaler från det extracellulära utrymmet, genomgår både sekretorisk och endocytisk transport. Vanliga metoder för att studera membranhandelshändelser med hjälp av ett plasmamembranlokaliserat leucinrikt-upprepa-receptorkinas, ERL1, beskrivs här. Tillvägagångssätten inkluderar beredning av växtmaterial, farmakologisk behandling och konfokal bildinställning. För att övervaka den spatiotemporala regleringen av ERL1 beskriver denna studie samlokaliseringsanalysen mellan ERL1 och ett multivesikulärt kroppsmarkörprotein, RFP-Ara7, tidsserieanalysen av dessa två proteiner och z-stackanalysen av ERL1-YFP behandlad med membranhandelshämmarna brefeldin A och wortmannin.

Introduction

Membrantrafik är en konserverad cellulär process som distribuerar membrankomponenter (även kända som laster), inklusive proteiner, lipider och andra biologiska produkter, mellan olika organeller inom en eukaryot cell eller över plasmamembranet till och från det extracellulära utrymmet¹. Denna process underlättas av en samling membran och organeller som heter endomembransystemet, som består av kärnmembranet, endoplasmatisk retikulum, Golgi-apparaten, vakuolen / lysosomerna, plasmamembranet och flera endosomer¹. Endomembransystemet möjliggör modifiering, förpackning och transport av membrankomponenter med hjälp av dynamiska vesiklar som pendlar mellan dessa organeller. Membranhandel är avgörande för cellutveckling, tillväxt och miljöanpassning och omfattas därför av sträng och komplex reglering². För närvarande har flera metoder inom molekylärbiologi, kemisk biologi, mikroskopi och masspektrometri utvecklats och tillämpats på membranhandeln och har i hög grad avancerat förståelsen för den spatiotemporala regleringen av endomembransystemet ^3,4. Molekylärbiologi används för klassiska genetiska manipulationer av de förmodade aktörerna som är involverade i membranhandel, såsom att ändra genuttrycket för proteinet av intresse eller märka proteinet av intresse med vissa taggar. Verktyg inom kemisk biologi inkluderar användning av molekyler som specifikt stör trafiken på vissa rutter ^4,5. Masspektrometri är kraftfull för att identifiera komponenterna i en organell som har isolerats mekaniskt med biokemiska metoder ^3,4. Membrantrafik är emellertid en dynamisk, mångsidig och komplex biologisk process¹. För att visualisera membranhandelsprocessen i levande celler under olika förhållanden är ljusmikroskopi ett viktigt verktyg. Kontinuerliga framsteg har gjorts i avancerade mikroskoptekniker för att övervinna utmaningarna med att mäta händelsernas effektivitet, kinetik och mångfald⁴. Här fokuserar denna studie på de allmänt antagna metoderna inom kemisk/farmakologisk biologi, molekylärbiologi och mikroskopi för att studera membranhandelshändelser i ett naturligt förenklat och experimentellt tillgängligt system, den stomatala utvecklingsprocessen.

Stomata är mikroporer på växtluftytor som öppnas och stängs för att underlätta gasutbytet mellan de inre cellerna och miljön ^6,7,8. Därför är stomata avgörande för fotosyntes och transpiration, två händelser som är avgörande för växtöverlevnad och tillväxt. Stomatal utveckling justeras dynamiskt av miljösignaler för att optimera växtens anpassning till omgivningen⁹. Med anor från studier 2002 öppnade identifieringen av receptorproteinet Too Many Mouths (TMM) dörren till en ny era för att undersöka de molekylära mekanismerna för stomatal utveckling i modellväxten Arabidopsis thaliana¹⁰. Efter bara några decennier har en klassisk signalväg identifierats. Från uppströms till nedströms innefattar denna väg en grupp sekretoriska peptidligander i familjen epidermala mönsterfaktorer (EFP), flera cellyte-leucinrik-upprepning (LRR) receptorkinaser i EREECTA (ER) -familjen, LRR-receptorproteinet TMM, en MAPK-kaskad och flera bHLH-transkriptionsfaktorer inklusive SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA och SCREAM (SCRM) ^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Tidigare forskning indikerar att en av receptorkinaserna, ER-LIKE 1 (ERL1), visar aktiva subcellulära beteenden vid EPF-uppfattning²⁰. ERL2 trafikerar också dynamiskt mellan plasmamembranet och vissa intracellulära organeller²⁷. Blockering av membrantransportstegen orsakar onormal stomatalmönstring, vilket resulterar i stomatalkluster på bladytan²⁸. Dessa resultat tyder på att membrantrafik spelar en viktig roll i stomatal utveckling. Denna studie beskriver ett protokoll för att spatiotemporalt undersöka ERL1-dynamiken med hjälp av protein-protein subcellulär samlokaliseringsanalys i kombination med farmakologisk behandling med användning av vissa membranhandelshämmare.

Protocol

1. Beredning av lösningarna Bered frösteriliseringslösning genom att blanda 15 ml blekmedel med 35 ml destillerat vatten och 50 μL Triton X-100. Bered brefeldin A (BFA)-lösning genom att lösa BFA-pulvret i etanol till en slutlig koncentration på 10 mM (stam). Bered wortmannin (Wm) lösning genom att lösa Wm pulvret i DMSO till en slutlig koncentration av 10 mM (lager). 2. Såning av fröna Alikvot 10-50 frön från v…

Representative Results

En tidigare studie indikerade att ERL1 är ett aktivt receptorkinas som genomgår dynamiska membranhandelshändelser20. ERL1 är ett transmembrant LRR-receptorkinas på plasmamembranet. Nysyntetiserad ERL1 i endoplasmatisk retikulum bearbetas i Golgi-kropparna och transporteras vidare till plasmamembranet. ERL1-molekylerna på plasmamembranet kan uppfatta EPF-ligander med hjälp av deras extracellulära LRR-domän18. Vid aktivering av de hämmande EPF: erna, inklusive EPF1,…

Discussion

Endomembransystemet separerar cytoplasman hos en eukaryot cell i olika fack, vilket möjliggör den specialiserade biologiska funktionen hos dessa organeller. För att leverera lastproteiner och makromolekyler till sin slutdestination vid rätt tidpunkt styrs många vesiklar till skyttel mellan dessa organeller. Starkt reglerade membranhandelshändelser spelar grundläggande roller i cellernas livskraft, utveckling och tillväxt. Kunskapen om mekanismen för denna avgörande och komplicerade process är fortfarande brist…

Materials

10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug