Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.
El microSiM (μSiM) es una plataforma de cultivo basada en membranas para modelar la barrera hematoencefálica (BBB). A diferencia de las plataformas convencionales basadas en membranas, el μSiM proporciona a los experimentadores nuevas capacidades, como la obtención de imágenes de células vivas, la señalización paracrina sin obstáculos entre las cámaras de “sangre” y “cerebro”, y la capacidad de obtener imágenes directas de la inmunofluorescencia sin necesidad de extraer/volver a montar las membranas. Aquí demostramos el uso básico de la plataforma para establecer modelos de monocultivo (células endoteliales) y cocultivo (células endoteliales y pericitos) de la BHE utilizando membranas nanoporosas ultrafinas de nitruro de silicio. Demostramos compatibilidad tanto con cultivos celulares primarios como con cultivos de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Proporcionamos métodos para el análisis cualitativo de modelos de BBB mediante tinción de inmunofluorescencia y demostramos el uso de μSiM para la evaluación cuantitativa de la función de barrera en un ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas. Los métodos proporcionados deberían permitir a los usuarios establecer sus modelos de barrera en la plataforma, avanzando en el uso de la tecnología de chips de tejido para estudiar tejidos humanos.
Los tejidos vivos están compartimentados por células especializadas que crean y mantienen barreras y regulan qué células y moléculas se transportan de un compartimento a otro. La regulación inadecuada de las funciones de barrera puede ser el origen tanto de enfermedades agudas como de enfermedades crónicas. La barrera hematoencefálica (BHE) es la barrera tisular más restrictivadel cuerpo humano. La disfunción de la barrera hematoencefálica subyace a una amplia gama de enfermedades del sistema nervioso central (SNC), como la enfermedad de Alzheimer2, la enfermedad de Parkinson3,4 y la esclerosis múltiple 5,6. La lesión de la barrera hematoencefálica también está relacionada con el deterioro cognitivo a largo plazo como resultado de trastornos agudos, como la sepsis7, la COVID-198 y el delirio postoperatorio9. El desarrollo de fármacos con el potencial de tratar trastornos cerebrales ha sido frustrantemente difícil debido al desafío de romper intencionalmente la barrera hematoencefálica para entregar moléculas bioactivas a objetivos enel cerebro. Por estas razones, los métodos para estudiar la función de la BHE in vitro son de suma importancia para la comprensión y el tratamiento de las enfermedades del SNC.
Los métodos básicos para medir la función barrera in vitro implican el establecimiento de una monocapa o cocultivo sobre una membrana semipermeable y la medición de la resistencia impartida por las células a la difusión de moléculas pequeñas o a las pequeñas corrientes eléctricas11,12,13,14. Si bien la aparición de los sistemas microfisiológicos (MPS) ha producido una gran cantidad de opciones para modelar la BHE en 3D15,16, la diversidad de geometrías de los sistemas dificulta la comparación de las mediciones de permeabilidad entre MPS o con los valores establecidos en la literatura. El establecimiento de valores basales confiables es particularmente importante en la investigación de BHE donde, debido a la extensa regulación de barrera por parte de las células endoteliales vasculares cerebrales, los valores de permeabilidad in vitro son altamente examinados 12,17,18. Por estas razones, las mediciones de permeabilidad a través de monocapas establecidas en membranas 2D seguirán siendo un elemento básico en los estudios de BBB en los próximos años. Esto es válido para otras barreras tisulares, incluidas las barreras epiteliales, donde los valores absolutos de permeabilidad basal se utilizan para validar y comparar modelos in vitro 19,20,21.
Con el objetivo de establecer una nueva herramienta valiosa para la comunidad de investigación de BBB, hemos introducido 22 yavanzado 23,24,25,26 el microdispositivoque presenta una plataforma de embrano de silicio (μSiM) para su uso en el modelado de tejido de barrera durante los últimos 5 años. La característica habilitante de la plataforma es una membrana ultrafina (<100 nm de espesor) con cientos de millones de nanoporos 27,28 o una mezcla de nanoporos y microporos29. Los chips de membrana independientes se producen en un “chip” de silicio de 300 μm que estabiliza las estructuras ultrafinas30 y permite manipularlas con pinzas para el montaje del dispositivo. Debido a su naturaleza ultrafina, las membranas tienen una permeabilidad que es dos órdenes de magnitud superior a la de las membranas convencionales grabadas con trazas utilizadas en dispositivos comerciales de cultivo de membranas31,32. En la práctica, esto significa que el obstáculo de la membrana para la difusión de moléculas más pequeñas que los nanoporos (<60 nm) es insignificante33. Por lo tanto, para las barreras celulares, solo las células y las matrices que depositan determinarán la velocidad de transporte de moléculas pequeñas desde los compartimentos apicales a los basales que están separados por la membrana34. El diseño del dispositivo y la naturaleza ultrafina de las membranas también proporcionan muchas ventajas para la microscopía óptica. Estos incluyen 1) la capacidad de seguir cultivos vivos utilizando contraste de fase o imágenes de campo claro, 2) la capacidad de teñir con fluorescencia e imágenes in situ sin la necesidad de extraer y transferir la membrana a un cubreobjetos, y 3) el hecho de que las membranas son más delgadas que las “rebanadas” confocales, de modo que los cocultivos directos tienen un espaciado más natural entre los tipos de células que el que se puede lograr con membranas grabadas con pistas de 6-10 μm de espesor.
Más recientemente, hemos avanzado la plataforma a un formato modular para facilitar el montaje rápido34 y la personalización35,36. Aprovechamos el formato modular para distribuir los componentes de los dispositivos entre nuestros laboratorios de bioingeniería y los laboratorios colaboradores de barrera cerebral. A continuación, desarrollamos conjuntamente protocolos para el ensamblaje de dispositivos, el monocultivo y el cocultivo, la tinción inmunofluorescente y la permeabilidad de moléculas pequeñas, y demostramos que estos métodos eran reproducibles entre laboratorios. Utilizando estos protocolos, también demostramos que la plataforma modular es compatible con una BHE validada desarrollada utilizando el método de cultivo endotelial extendido (EECM) para crear células endoteliales cerebrales de tipo microvascular (BMEC) a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs)37. El propósito del presente informe es revisar estos métodos con mayor detalle y, con la ayuda del video que lo acompaña, facilitar una adopción más amplia de la plataforma en la comunidad BBB.
Si bien las virutas de membrana han sido diseñadas para brindar estabilidad, pueden agrietarse o romperse si se manipulan incorrectamente durante el ensamblaje. Por lo tanto, es fundamental agarrar el chip en las muescas de la pinza de virutas y colocarlo suavemente en el accesorio. Al manipular los dispositivos en general, se deben tomar precauciones adicionales para no golpear ni dejar caer los dispositivos. Durante la unión de la viruta de membrana al accesorio A1, el chip debe colocarse plano y centrado en el pilar del accesorio A1 para evitar que la membrana se agriete durante la unión al componente 1. Además, se debe evitar cualquier contacto con las capas de PSA expuestas después de quitarse las máscaras protectoras. Al manipular el componente 2 después de quitar las máscaras protectoras, es aconsejable sostenerlo a lo largo del borde del componente y usar pinzas para agarrar la esquina triangular que no tiene PSA.
Si bien se describieron protocolos de cultivo celular para posibles modelos de BHE, el modelo de cocultivo BMEC/pericito de la BHE descrito aquí puede ser suficiente o insuficiente dependiendo del contexto fisiológico y de las cuestiones de interés. Por ejemplo, el tráfico de células inmunitarias se produce principalmente en las vénulas postcapilares del cerebro41,42. En estas regiones, un espacio perivascular separa la barrera BMEC/pericitos de los limitantes gliales establecidos por los astrocitos. Por lo tanto, en las vénulas postcapilares, la unidad neurovascular (VU) comprende dos barreras físicamente separadas en serie, y los pies terminales astrocíticos no entran en contacto directo con la barrera sanguínea BMEC/pericitos, que está bien representada por el modelo actual. Si el objetivo es un modelo de NVU que tenga en cuenta el impacto de los factores secretados por los astrocitos en la barrera hematológica, se podría añadir un compartimento de astrocitos al dispositivo que permita el intercambio de factores solubles a través del espacio perivascular. Este ejemplo se ilustró anteriormente34 y podría ampliarse para incluir otras células, como la microglía y las neuronas, en un compartimento “cerebral” 3D. La arquitectura modular de la plataforma permite utilizar estrategias de ensamblaje simples para lograr estas reconfiguraciones, de modo que la plataforma sea tan simple o compleja como sea necesario para abordar las hipótesis en cuestión. Cada configuración de cultivo celular; sin embargo, debe optimizarse para nuevas líneas celulares y multicultivos. Por ejemplo, debido a las propiedades de las membranas de nitruro de silicio, es posible que sea necesario ajustar las soluciones de recubrimiento en comparación con las placas de cultivo de tejidos. La inclusión de fibronectina generalmente ayuda en la unión celular y la supervivencia. Además, los usuarios podían cultivar células endoteliales y pericitos en direcciones opuestas. En este caso, puede ser necesario modificar, por ejemplo, la forma en que se realizan e interpretan las mediciones de permeabilidad. Sin embargo, proporcionar pasos para este tipo de cultura está más allá del alcance de este documento.
Otro desafío que se puede encontrar durante el cultivo celular es la rápida evaporación de los medios, ya que los dispositivos pueden ser más sensibles a las alteraciones en el medio ambiente en comparación con las placas y matraces estándar de cultivo de tejidos. Si se observa un exceso de evaporación o se ralentiza el crecimiento celular, se deben medir todos los parámetros críticos de la incubadora para garantizar ajustes precisos. Se puede agregar más agua a la tapa de tejido o a la pequeña placa de Petri colocada dentro de la cámara de cultivo celular, o se deben intercambiar medios con más frecuencia. Además, las burbujas pueden entrar en el canal inferior y atascarse en la zanja para los dispositivos de excavación de zanjas. Si bien se pueden eliminar, es más fácil evitar agregar burbujas en primer lugar. Para ello, es importante comprobar que no haya burbujas en la punta de la pipeta ni aire en el extremo de la punta de la pipeta antes de pipetear los medios en la cámara inferior. Además, la evaporación de los medios en el canal puede provocar un espacio entre la superficie de los medios y la parte superior del puerto. Se puede pipetear un pequeño volumen de medios en un puerto hasta que el medio llegue a la superficie del puerto opuesto, después de lo cual los medios se pueden intercambiar en ese puerto opuesto. Si bien los medios hECSR y E6 + 10% FBS no deben calentarse en el baño de agua, otros medios se pueden precalentar para reducir la formación de burbujas. Si entra una burbuja en la cámara inferior, se puede eliminar pipeteando rápidamente 100 μL a través del canal. Sin embargo, este método puede provocar contaminación entre cámaras o medios derramados por la superficie del dispositivo. También puede alterar las capas celulares. Alternativamente, los medios se pueden eliminar primero del canal y luego volver a introducirse con un volumen de 50 μL. Sin embargo, quitar primero los medios puede dar lugar a una mayor formación de burbujas en el canal. Si una burbuja no está directamente debajo del área de la membrana, puede dejarse en el canal sin efectos sobre el cultivo celular.
La adhesión y el crecimiento de los pericitos, como se demuestra en la Figura 2, pueden ser un desafío. El uso de una densidad de siembra optimizada es esencial para la formación de una capa con una proporción de células pericitos a endoteliales fisiológicamente relevante. Además, como los pericitos son sensibles al cizallamiento, todos los intercambios de medios en el canal deben realizarse muy lentamente para proteger las células. Para el cultivo de BPLC, se puede lograr una mejor adhesión recubriendo la cámara inferior con 800 μg/mL de colágeno tipo IV o 100 μg/mL de fibronectina.
La inmunocitoquímica en los dispositivos aquí descritos permite el análisis cualitativo de la salud y la función celular. Los métodos de tinción en placas de cultivo de tejidos u otras plataformas deben ser directamente traducibles a la plataforma. Para el cultivo celular solo en la cámara superior, después de la fijación, se puede agregar PBS en la cámara inferior y dejarse para los pasos restantes, con el bloqueo y la tinción realizados solo en la cámara superior. Esto minimiza los riesgos de romper las membranas o de que entren burbujas en la cámara inferior. Para la tinción de cocultivo, recomendamos utilizar ambas cámaras en todos los pasos. Es importante tener en cuenta que la viscosidad del fijador y PBS es diferente a la de los medios. Por lo tanto, puede ser más fácil agregar burbujas en la cámara inferior, y se debe tener especial cuidado al verificar si hay aire en las puntas de las pipetas en el extremo de la punta antes de pipetear en la cámara inferior.
El protocolo descrito para el ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas permite la evaluación funcional y cuantitativa de la función barrera de las células endoteliales cultivadas en el dispositivo μSiM. Un problema que puede surgir durante este ensayo es la extracción de burbujas de aire en la pipeta durante la recogida de muestras desde el canal inferior en el paso del protocolo 4.1.7.4. Para evitar este problema, es importante asegurarse de que la punta esté sellada en el puerto antes de comenzar la recolección de muestras y que la muestra no se extraiga demasiado rápido. Si eso no resuelve el problema, el tamaño de las puntas utilizadas puede ser demasiado pequeño o demasiado grande para caber en los puertos; utilice los consejos que se enumeran en la Tabla de materiales. Si se miden valores de permeabilidad inesperadamente altos a pesar de una monocapa confluente de aspecto saludable, se debe comprobar la integridad de la monocapa para detectar alteraciones durante la recogida de muestras. Recomendamos comprobar siempre la monocapa bajo el microscopio inmediatamente después de la recogida de la muestra. Si la monocapa sigue intacta y sana, se puede fijar la muestra y evaluar los marcadores biológicos de la función de barrera, por ejemplo, mediante inmunotinción de las proteínas de unión. Por el contrario, si se miden valores de permeabilidad inesperadamente bajos, es importante asegurarse de que se muestrean 50 μL de medio desde el canal inferior sin burbujas de aire. Si el medio sale del puerto de muestreo tan pronto como se coloca la punta del depósito, ese medio debe recogerse antes de colocar la pipeta en el puerto de muestreo, ya que la mayor parte de la pequeña molécula fluorescente estará presente en el volumen inicial de 10 μL muestreado desde el canal inferior. Dibujar círculos alrededor de los puertos con un bolígrafo hidrofóbico o colocar una cinta hidrofóbica con un orificio alrededor del puerto evita que se extiendan los medios bombeados pasivamente. Si se retiran burbujas durante el muestreo o no se retira la muestra completa de 50 μl, no se debe utilizar la muestra. Alternativamente, se puede determinar el volumen exacto y utilizarlo en el cálculo de la permeabilidad; sin embargo, esto solo debe hacerse si el volumen eliminado es de ≥40 μL, lo que corresponde a ~98-99% de recuperación de colorante34.
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. y L.W. fueron financiados por la subvención R33 HL154249 de los NIH. J.L.M. fue financiado por R44 GM137651. M.M. fue financiado por el Premio del Programa Schmidt del Instituto Del Monte de Neurociencia, Universidad de Rochester. M.T. fue financiado por RF1 AG079138. K.C. fue financiado por la Fundación Internacional para la Investigación Ética.
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
기타 | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |