Denna rapport tillhandahåller protokoll för montering, cellodling och analyser på μSiM-plattformen för konstruktion av blod-hjärnbarriärmodeller.
MicroSiM (μSiM) är en membranbaserad odlingsplattform för modellering av blod-hjärnbarriären (BBB). Till skillnad från konventionella membranbaserade plattformar ger μSiM experimentalister nya möjligheter, inklusive avbildning av levande celler, obehindrad parakrin signalering mellan “blod” och “hjärn”-kammare, och förmågan att direkt avbilda immunofluorescens utan behov av extraktion/återmontering av membran. Här demonstrerar vi den grundläggande användningen av plattformen för att etablera monokultur (endotelceller) och samkultur (endotelceller och pericyter) modeller av BBB med hjälp av ultratunna nanoporösa kiselnitridmembran. Vi visar kompatibilitet med både primära cellkulturer och humana inducerade pluripotenta stamcellskulturer (hiPSC). Vi tillhandahåller metoder för kvalitativ analys av BBB-modeller via immunofluorescensfärgning och demonstrerar användningen av μSiM för kvantitativ bedömning av barriärfunktion i en småmolekylär permeabilitetsanalys. De metoder som tillhandahålls bör göra det möjligt för användare att etablera sina barriärmodeller på plattformen, vilket främjar användningen av vävnadschipteknik för att studera mänskliga vävnader.
Levande vävnader delas upp av specialiserade celler som skapar och upprätthåller barriärer och reglerar vilka celler och molekyler som transporteras från ett fack till ett annat. Felaktig reglering av barriärfunktioner kan vara källan till både akuta sjukdomar och kroniska sjukdomar. Blod-hjärnbarriären (BBB) är den mest restriktiva vävnadsbarriären i människokroppen1. Dysfunktion i BBB ligger till grund för ett brett spektrum av sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS), inklusive Alzheimers sjukdom2, Parkinsons sjukdom3,4 och multipel skleros 5,6. Skada på BBB är också kopplad till långvarig kognitiv försämring som ett resultat av akuta störningar, såsom sepsis7, COVID-198 och postoperativt delirium9. Utvecklingen av läkemedel med potential att behandla hjärnsjukdomar har varit frustrerande svår på grund av utmaningen att avsiktligt bryta mot BBB för att leverera bioaktiva molekyler till mål i hjärnan10. Av dessa skäl är metoder för att studera BBB-funktion in vitro av största vikt för förståelsen och behandlingen av sjukdomar i CNS.
De grundläggande metoderna för att mäta barriärfunktion in vitro innebär att ett monolager eller samkultur etableras på ett semipermeabelt membran och att man mäter det motstånd som cellerna ger mot antingen diffusion av små molekyler eller små elektriska strömmar11,12,13,14. Även om framväxten av mikrofysiologiska system (MPS) har gett ett överflöd av val för modellering av BBB i 3D15,16, gör mångfalden av systemgeometrier det svårt att jämföra permeabilitetsmätningar mellan MPS eller med etablerade litteraturvärden. Fastställandet av tillförlitliga baslinjevärden är särskilt viktigt inom BBB-forskning där, på grund av den omfattande barriärregleringen av hjärnans vaskulära endotelceller, permeabilitetsvärden in vitro granskas noggrant12,17,18. Av dessa skäl kommer permeabilitetsmätningar över monolager som etablerats på 2D-membran att förbli en stapelvara i BBB-studier i många år framöver. Detta gäller för andra vävnadsbarriärer, inklusive epitelbarriärer, där absoluta värden för permeabilitet vid baslinjen används för att validera och jämföra in vitro-modeller 19,20,21.
Med målet att etablera ett värdefullt nytt verktyg för BBB-forskarsamhället har vi introducerat 22 och avancerade23,24,25,26 mikroenhetenmed en kisel m-embranplattform(μSiM) för användning i barriärvävnadsmodellering under de senaste 5 åren. Plattformens möjliggörande egenskap är ett ultratunt (<100 nm tjockt) membran med hundratals miljoner nanoporer 27,28 eller en blandning av nanoporer och mikroporer29. De fristående membranchipsen tillverkas på ett 300 μm kiselchip som stabiliserar de ultratunna strukturerna30 och gör att de kan hanteras av pincetter för montering av enheter. På grund av sin ultratunna natur har membranen en permeabilitet som är två storleksordningar högre än för konventionella spåretsade membran som används i kommersiella membranodlingsenheter31,32. I praktiken innebär detta att membranets hinder för diffusion av molekyler som är mindre än nanoporerna (<60 nm) är försumbart33. Således, för cellulära barriärer, kommer endast cellerna och matriserna de deponerar att bestämma hastigheten för transport av små molekyler från de apikala till basala facken som separeras av membranet34. Enhetens design och membranens ultratunna natur ger också många fördelar för optisk mikroskopi. Dessa inkluderar 1) förmågan att följa levande kulturer med hjälp av faskontrast eller ljusfältsavbildning, 2) förmågan att fluorescerande färga och avbilda på plats utan att behöva extrahera och överföra membranet till ett täckglas, och 3) det faktum att membranen är tunnare än konfokala “skivor” så att direkta samkulturer har ett mer naturligt avstånd mellan celltyperna än vad som kan uppnås med 6-10 μm tjocka spåretsade membran.
Nyligen avancerade vi plattformen till ett modulärt format för att underlätta snabb montering34 och anpassning35,36. Vi utnyttjade det modulära formatet för att distribuera enhetskomponenter mellan våra biotekniska och samarbetande hjärnbarriärlaboratorier. Vi utvecklade sedan gemensamt protokoll för enhetsmontering, monokultur och samodling, immunofluorescensfärgning och permeabilitet för små molekyler och visade att dessa metoder var reproducerbara mellan laboratorier. Med hjälp av dessa protokoll visade vi också att den modulära plattformen stöder en validerad BBB som utvecklats med hjälp av den utökade endotelodlingsmetoden (EECM) för att skapa mikrovaskulära endotelceller i hjärnan (BMEC) från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs)37. Syftet med den aktuella rapporten är att granska dessa metoder mer i detalj och, med hjälp av den medföljande videon, underlätta en bredare användning av plattformen i BBB-communityt.
Även om membranspån har utformats för stabilitet, kan de spricka eller gå sönder om de hanteras felaktigt under monteringen. Därför är det viktigt att ta tag i chipet i chippincettens skåror och försiktigt placera det i fixturen. Vid hantering av enheterna i allmänhet måste extra försiktighet iakttas för att inte stöta eller tappa enheterna. Under bindningen av membranchipet till fixtur A1 måste chipet läggas plant och centrerat på pelaren i fixtur A1 för att undvika membransprickor under bindningen till komponent 1. Dessutom måste all kontakt med de exponerade PSA-skikten undvikas efter att skyddsmaskerna har tagits bort. Vid hantering av komponent 2 efter att skyddsmaskerna tagits bort är det lämpligt att hålla den längs komponentens kant och använda en pincett för att ta tag i triangelhörnet som är PSA-fritt.
Medan cellodlingsprotokoll beskrevs för möjliga BBB-modeller, kan BMEC/pericyt-samodlingsmodellen för BBB som beskrivs här vara tillräcklig eller otillräcklig beroende på det fysiologiska sammanhanget och frågor av intresse. Till exempel sker handeln med immunceller till stor del i hjärnans postkapillära venoler41,42. I dessa regioner separerar ett perivaskulärt utrymme BMEC/pericytbarriären från glia-limitanerna som etableras av astrocyter. I postkapillära venoler består den neurovaskulära enheten (NVU) av två fysiskt separerade barriärer i serie, och astrocytiska ändfötter kommer inte direkt i kontakt med BMEC/pericyt-blodbarriären, vilket är väl representerat av den nuvarande modellen. Om målet är en NVU-modell som tar hänsyn till effekten av astrocytutsöndrade faktorer på blodbarriären, kan ett astrocytfack läggas till enheten som möjliggör lösligt faktorutbyte genom det perivaskulära utrymmet. Detta exempel illustrerades tidigare34 och skulle kunna utvidgas till att omfatta andra celler som mikroglia och neuroner i ett 3D-“hjärnfack”. Plattformens modulära arkitektur gör det möjligt att använda enkla monteringsstrategier för att uppnå dessa omkonfigurationer så att plattformen är så enkel eller komplex som behövs för att hantera de aktuella hypoteserna. Varje cellodlingsuppsättning; måste dock optimeras för nya cellinjer och multikulturer. Till exempel, på grund av egenskaperna hos kiselnitridmembranen, kan beläggningslösningar behöva justeras jämfört med vävnadsodlingsplattor. Införandet av fibronektin hjälper vanligtvis till med cellbindning och överlevnad. Vidare kunde användarna odla endotelceller och pericyter i motsatta riktningar. I detta fall kan det till exempel vara nödvändigt att ändra hur permeabilitetsmätningarna görs och tolkas. Att tillhandahålla steg för denna typ av kultur ligger dock utanför ramen för detta dokument.
En annan utmaning man kan stöta på under cellodling är den snabba avdunstningen av media eftersom enheterna kan vara känsligare för förändringar i miljön jämfört med vanliga vävnadsodlingsplattor och kolvar. Om överdriven avdunstning ses eller celltillväxt saktas ner måste alla kritiska inkubatorparametrar mätas för att säkerställa korrekta inställningar. Mer vatten kan tillsättas till vävnadslocket eller den lilla petriskålen som placeras inuti cellodlingskammaren, eller så måste media bytas oftare. Vidare kan bubblor komma in i den nedre kanalen och fastna i diket för dikesgrävningsanordningar. Även om de kan tas bort är det lättast att undvika att lägga till bubblor i första hand. För att göra detta är det viktigt att kontrollera att det inte finns några bubblor i pipettspetsen eller luft i änden av pipettspetsen innan du pipetterar media i bottenkammaren. Dessutom kan medieavdunstning i kanalen leda till ett mellanrum mellan medieytan och babords överdel. En liten volym media kan pipetteras in i en port tills mediet når ytan på den motsatta porten, varefter mediet kan bytas ut i den motsatta porten. Medan hECSR- och E6 + 10 % FBS-media inte bör värmas upp i vattenbadet, kan andra medier förvärmas för att minska bubbelbildningen. Om en bubbla kommer in i bottenkammaren kan den avlägsnas genom att snabbt pipettera 100 μL genom kanalen. Denna metod kan dock leda till kontaminering mellan kamrar eller media som spills över enhetens yta. Det kan också störa cellskikten. Alternativt kan mediet först tas bort från kanalen och sedan återinföras med en volym på 50 μL. Om du tar bort mediet först kan det dock leda till att fler bubblor bildas i kanalen. Om en bubbla inte är direkt under membranområdet kan den lämnas kvar i kanalen utan att cellodlingen påverkas.
Pericytbindning och tillväxt, som visas i figur 2, kan vara utmanande. Att använda en optimerad såddtäthet är avgörande för bildandet av ett lager med ett fysiologiskt relevant förhållande mellan pericyter och endotelceller. Vidare, eftersom pericyterna är känsliga för skjuvning, bör alla medieutbyten i kanalen göras mycket långsamt för att skydda cellerna. För BPLC-odling kan förbättrad vidhäftning uppnås genom att belägga bottenkammaren med 800 μg/ml kollagen typ IV eller 100 μg/ml fibronektin.
Immunocytokemi i enheter som beskrivs här möjliggör kvalitativ analys av cellhälsa och funktion. Metoder för färgning i vävnadsodlingsplattor eller andra plattformar bör vara direkt översättbara till plattformen. För cellodling i endast den övre kammaren, efter fixering, kan PBS tillsättas i den nedre kammaren och lämnas för de återstående stegen, med blockering och färgning endast i den övre kammaren. Detta minimerar riskerna för att membranen går sönder eller att det kommer in bubblor i bottenkammaren. För färgning av samkulturer rekommenderar vi att du använder båda kamrarna i alla steg. Det är viktigt att notera att viskositeten hos fixeringsmedlet och PBS skiljer sig från medias. Således kan det vara lättare att lägga till bubblor i bottenkammaren, och extra försiktighet bör iakttas för att kontrollera pipettspetsarna för luft i slutet av spetsen innan pipettering i bottenkammaren.
Protokollet som beskrivs för permeabilitetsanalysen för små molekyler möjliggör funktionell och kvantitativ bedömning av barriärfunktionen hos endotelcellerna som odlas i μSiM-enheten. Ett problem som kan uppstå under denna analys är att luftbubblor dras in i pipetten under provtagningen från den nedre kanalen vid protokollsteg 4.1.7.4. För att undvika detta problem är det viktigt att se till att spetsen är förseglad i porten innan provtagningen påbörjas och sample bör inte dras för snabbt. Om det inte löser problemet kan storleken på de spetsar som används vara för små eller för stora för att passa in i portarna; använd tipsen som anges i materialförteckningen. Om oväntat höga permeabilitetsvärden mäts trots ett konfluentt monolager som ser friskt ut, måste monolagrets integritet kontrolleras för störningar under provtagningen. Vi rekommenderar att du alltid kontrollerar monolagret under mikroskopet omedelbart efter provtagningen. Om monolagret fortfarande verkar intakt och friskt kan provet fixeras och biologiska markörer för barriärfunktion kan bedömas, till exempel genom immunfärgning av korsningsproteinerna. Omvänt, om oväntat låga permeabilitetsvärden mäts, är det viktigt att se till att 50 μL media provtas från bottenkanalen utan några luftbubblor. Om medium kommer ut från provtagningsporten så snart reservoarspetsen är placerad, måste detta medium samlas upp innan pipetten monteras i provtagningsporten, eftersom det mesta av den fluorescerande småmolekylen kommer att finnas i den första 10 μL-volymen som provtas från bottenkanalen. Att rita cirklar runt portarna med en hydrofob penna eller placera en hydrofob tejp med ett hål runt porten förhindrar att passivt pumpade medier sprids. Om bubblor dras ut under provtagningen eller om hela 50 μL-provet inte avlägsnas får provet inte användas. Alternativt kan den exakta volymen bestämmas och användas i permeabilitetsberäkningen; Detta bör dock endast göras om den borttagna volymen är ≥40 μL, vilket motsvarar ~98-99% färgåtervinning34.
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. och L.W. finansierades av NIH-anslaget R33 HL154249. J.L.M. finansierades av R44 GM137651. M.M. finansierades av Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. finansierades av RF1 AG079138. K.C. finansierades av International Foundation for Ethical Research.
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
기타 | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |