التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر
Summary
ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.
Abstract
يتم إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بواسطة العدلات كاستجابة للعدوى البكتيرية أو تلف الأنسجة الرضحية ولكنها تلعب أيضا دورا في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات المعقمة. إنها هياكل تشبه الويب تتكون من خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والهستونات ، والبروتينات المضادة للميكروبات. بمجرد إطلاقها ، يمكن للشبكات أن تحبس وتقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، تشارك الشبكات في تنظيم الاستتباب عن طريق تحفيز التصاق الصفائح الدموية وتجلطها. ومع ذلك ، فقد ارتبط الإنتاج غير المنظم للشبكات أيضا بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الإنتان أو اضطرابات المناعة الذاتية ، مما يجعلها هدفا واعدا للتدخل العلاجي. بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، يعد تصور الشبكات باستخدام التصوير المناعي حاليا أحد الطرق الوحيدة المعروفة لإظهار تفاعلات NET في الأنسجة. لذلك ، تم استخدام طرق تلطيخ مختلفة لتصور NETs. في الأدبيات ، تم وصف بروتوكولات تلطيخ مختلفة ، وحددنا أربعة مكونات رئيسية تظهر تباينا كبيرا بين البروتوكولات: (1) أنواع الأجسام المضادة المستخدمة ، (2) استخدام عوامل تقليل التألق الذاتي ، (3) طرق استرجاع المستضد ، و (4) النفاذية. لذلك ، تم تكييف بروتوكولات التلوين المناعي في المختبر وتحسينها بشكل منهجي في هذا العمل لجعلها قابلة للتطبيق على الأنواع المختلفة (الفأر ، الإنسان) والأنسجة (الجلد والأمعاء والرئة والكبد والقلب والقرص الفقري). بعد التثبيت وتضمين البارافين ، تم تركيب أقسام بسمك 3 ميكرومتر على شرائح. تم تلطيخ هذه العينات بالأجسام المضادة الأولية ل myeloperoxidase (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، وإيلاستاز العدلات (NE) وفقا لبروتوكول تلطيخ معدل. تم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة ثانوية وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحليل النتائج وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات شبه الكمية.
هنا ، نقدم بروتوكول تلطيخ صافي محسن مناسب للأنسجة المختلفة. استخدمنا جسما مضادا أوليا جديدا لتلطيخ H3cit وقللنا من تلطيخ غير محدد بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن التلوين الصافي يتطلب درجة حرارة عالية ثابتة ومعالجة دقيقة للعينات.
Introduction
تم تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لأول مرة بواسطة Brinkmann et al. كمسار للموت الخلوي يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر في عام 20041. في هذا المسار ، تطلق العدلات الكروماتين غير المكثف في الفضاء خارج الخلية لتشكيل هياكل كبيرة تشبه الويب مغطاة بالبروتينات المضادة للميكروبات التي كانت مخزنة سابقا في الحبيبات أو العصارة الخلوية. تشمل هذه البروتينات المضادة للميكروبات إيلاستاز العدلات (NE) ، والميلوبيروكسيديز (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، والتي تستخدم عادة للكشف المناعي غير المباشر عن NETs2. هذه الطريقة لا تحدد فقط الوجود الكمي لهذه البروتينات. في الواقع ، لديها ميزة الكشف على وجه التحديد عن الهياكل الشبيهة بالشبكة. في الشبكات ، تتركز البروتينات المذكورة مع الحمض النووي خارج الخلية ، والذي يمكن اكتشافه من خلال تداخل الإشارات الفلورية لكل بروتين ملطخ والحمض النووي خارج الخلية. على عكس الإشارات المتداخلة بسبب الحمض النووي خارج الخلية والتوطين المشترك للبروتين في الشبكات ، لا تظهر العدلات السليمة أي توطين مشترك. هنا ، عادة ما يتم تخزين مكونات NET بشكل منفصل في الحبيبات والنوى والسيتوسول3.
منذ اكتشافها لأول مرة ، ثبت أن الشبكات تلعب دورا مركزيا في العديد من الأمراض ، لا سيما تلك التي تنطوي على التهاب. تظهر الشبكات وظائف مضادة للميكروبات أثناء العدوى من خلال محاصرة وقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة 4,5. ومع ذلك ، فقد تم ربط الشبكات أيضا بأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المفرطة الالتهاب ، مثل الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتيزمي والربو التحسسي6،7،8. تعزز الشبكات انسداد الأوعية والالتهابات في تصلب الشرايين ، والتصاق الصفائح الدموية ، ومن المتوقع أن تلعب دورا في السرطانالنقيلي 9،10،11. ومع ذلك ، يعتقد أن لها خصائص مضادة للالتهابات عن طريق تقليل مستويات السيتوكين المسببة للالتهابات12. بينما تكتسب الشبكات اهتماما أكبر بمجال أوسع من البحث ، فإن طريقة الكشف عن NET القوية أمر أساسي للبحث في المستقبل.
على الرغم من أن تصور الشبكات في الأنسجة المختلفة باستخدام التصوير المناعي معقد ويتطلب التخصيص ، بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، إلا أنه يعد حاليا أحد أشهر الطرق لتصور التفاعلات بين الشبكات والخلايا ويستخدم في الغالب في الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE)13,14. ومع ذلك ، فإن مقارنة التصوير NET أمر صعب ، حيث تستخدم المختبرات المختلفة بروتوكولاتها المخصصة. تختلف هذه البروتوكولات في استخدامها للأجسام المضادة أو استرجاع المستضد أو طريقة النفاذية وغالبا ما يتم تحسينها لنوع معين من الأنسجة3،13،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26، 27.
بعد أن نشر Brinkmann et al. أول دراسة منهجية باستخدام التصور المناعي الفلوري للشبكات في أنسجة FFPE ، أردنا تحسين هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من الأنسجة والأنواع15. بالإضافة إلى ذلك ، لإنشاء بروتوكول تألق مناعي قابل للتطبيق على نطاق واسع ، اختبرنا بروتوكولات معدلة مختلفة من الدراسات التي استخدمت طرق التألق المناعي في أنسجة FFPE للكشف عن الشبكات3،13،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25 ، 26,27. علاوة على ذلك ، جربنا جسما مضادا جديدا ل H3cit لتلطيخ أكثر تحديداخارج الخلية 28. نحن نفترض أنه من خلال تكييف بروتوكولات التلوين الحالية بشكل منهجي مع الأنواع والأنسجة المختلفة ، يمكن تحسين التصوير في المختبر ، مما يؤدي إلى تمثيل أفضل للتفاعل بين العدلات والشبكات محليا ومنهجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، كنا نهدف إلى تكييف وتحسين البروتوكولات الحالية لتصوير الشبكات لمزيد من أنواع الأنسجة ، بدءا من عملية التلوين الفعلية. الخطوة الأولى الحاسمة لهذه الطريقة هي اختيار الأجسام المضادة الأكثر ملاءمة. بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي لم يظ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تأسست هذه الأبحاث من قبل جمعية الأبحاث الألمانية (BO5534). نشكر أنطونيا كيويت وموريتز لينز ويوهانا هاجنز والدكتورة أنيكا هوير والأستاذة العامة الدكتورة إنغو كونيغس على تزويدنا بالعينات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون فريق مرفق التصوير المجهري UKE (المرفق الأساسي ، كلية الطب UKE) على الدعم في الفحص المجهري المناعي.
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
- Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
- Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
- Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
- Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
- Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
- Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
- Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
- Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
- de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
- Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
- Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
- Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
- Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
- Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
- Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
- Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
- Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
- Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
- Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
