Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши
Summary
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) связаны с различными заболеваниями, и для их визуализации часто используется иммунофлуоресценция. Тем не менее, существуют различные протоколы окрашивания, и во многих случаях исследуется только один тип ткани. Здесь мы устанавливаем общеприменимый протокол для окрашивания НВЛ в тканях мышей и человека.
Abstract
Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) высвобождаются нейтрофилами в ответ на бактериальную инфекцию или травматическое повреждение тканей, но также играют роль в аутоиммунных заболеваниях и стерильном воспалении. Они представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из двухцепочечных нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков. После высвобождения НВЛ могут захватывать и убивать внеклеточные патогены в крови и тканях. Кроме того, НВЛ участвуют в гомеостатической регуляции, стимулируя адгезию и коагуляцию тромбоцитов. Тем не менее, нарушение регуляции выработки НВЛ также связано с различными заболеваниями, включая сепсис или аутоиммунные расстройства, что делает их многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства. Помимо электронной микроскопии, визуализация НВЛ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации в настоящее время является одним из немногих известных методов демонстрации НВЛ-взаимодействий в тканях. Поэтому для визуализации НЭО используются различные методы окрашивания. В литературе описаны различные протоколы окрашивания, и мы выделили четыре ключевых компонента, демонстрирующих высокую вариабельность между протоколами: (1) типы используемых антител, (2) использование аутофлюоресцентных редуцирующих агентов, (3) методы получения антигена и (4) пермеабилизация. Поэтому протоколы иммунофлюоресцентного окрашивания in vitro были системно адаптированы и усовершенствованы в данной работе, чтобы сделать их применимыми для различных видов (мышей, человека) и тканей (кожа, кишечник, легкие, печень, сердце, межпозвоночные диски). После фиксации и заделки парафином на предметные стекла были установлены секции толщиной 3 мкм. Эти образцы окрашивали первичными антителами к миелопероксидазе (МПО), цитруллинированному гистону Н3 (Н3цит) и нейтрофильной эластазе (НЭ) в соответствии с модифицированным протоколом окрашивания. Предметные стекла окрашивали вторичными антителами и исследовали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Результаты анализировались в соответствии с оценочным листом, а различия фиксировались полуколичественно.
Здесь мы представляем оптимизированный протокол окрашивания NET, подходящий для различных тканей. Мы использовали новое первичное антитело для окрашивания H3cit и уменьшали неспецифическое окрашивание с помощью аутофлуоресцентного редуцирующего агента. Кроме того, мы продемонстрировали, что окрашивание НЭТ требует постоянной высокой температуры и бережного обращения с образцами.
Introduction
Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет количественное присутствие этих белков; более того, его преимущество заключается в специфическом обнаружении NET-подобных структур. В НВЛ упомянутые белки локализуются с внеклеточной ДНК, что может быть обнаружено по перекрытию сигналов флуоресценции каждого окрашенного белка и внеклеточной ДНК. В отличие от перекрывающихся сигналов, обусловленных внеклеточной локализацией ДНК и белков в НВЛ, интактные нейтрофилы не демонстрируют колокализации. Здесь компоненты НВЛ обычно хранятся отдельно в гранулах, ядрах и цитозоле3.
С момента их первого открытия было показано, что НВЛ играют центральную роль во многих заболеваниях, особенно в тех, которые связаны с воспалением. НВЛ проявляют антимикробные функции во время инфекции путем захвата и уничтожения внеклеточных патогенов в крови и тканях 4,5. Тем не менее, НВЛ также связаны с аутоиммунными заболеваниями и гипервоспалительными реакциями, такими как системная красная волчанка, ревматический артрит и аллергическая астма 6,7,8. НВЛ способствуют вазоокклюзии и воспалению при атеросклерозе, адгезии тромбоцитов и, как предполагается, играют роль в развитии метастатического рака 9,10,11. Тем не менее, считается, что они обладают противовоспалительными свойствами, снижая уровень провоспалительных цитокинов12. В то время как НЭО вызывают все больший интерес в более широкой области исследований, надежный метод обнаружения НЭО имеет фундаментальное значение для будущих исследований.
Несмотря на то, что визуализация НВЛ в различных тканях с помощью иммунофлуоресцентной визуализации сложна и требует адаптации, помимо электронной микроскопии, в настоящее время она является одним из наиболее известных методов визуализации взаимодействий между НВЛ и клетками и преимущественно используется в фиксированных формалином тканях, залитых парафином (FFPE)13,14. Тем не менее, сравнение NET-изображений затруднено, так как разные лаборатории используют свои собственные индивидуальные протоколы. Эти протоколы отличаются использованием антител, методом извлечения антигена или пермеабилизации и часто оптимизированы для определенного типа тканей 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
После того, как Brinkmann et al. опубликовали первое методическое исследование с использованием иммунофлуоресцентной визуализации НВЛ в тканях FFPE, мы захотели оптимизировать этот протокол для более широкого спектра тканей ивидов15. Кроме того, чтобы создать широко применимый протокол иммунофлюоресценции, мы протестировали различные модифицированные протоколы исследований, в которых использовались методы иммунофлуоресценции в тканях FFPE для обнаружения НВЛ 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Кроме того, мы попробовали новое антитело H3cit для более специфического внеклеточного окрашивания28. Мы предполагаем, что, систематически адаптируя существующие протоколы окрашивания к различным видам и тканям, визуализация in vitro может быть улучшена, что приведет к лучшему представлению взаимодействия между нейтрофилами и НВЛ как локально, так и системно.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы стремились адаптировать и оптимизировать существующие протоколы визуализации НЭО для большего количества типов тканей, начиная с самого процесса окрашивания. Первым критическим шагом для этого метода является выбор наиболее подходящих антител. Для НЭ мы попробовали …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было основано Немецким научно-исследовательским обществом (BO5534). Мы благодарим Антонию Кивитт, Морица Ленца, Йоханну Хагенс, д-ра Аннику Хойер и приват-доцента д-ра Инго Кёнигса за предоставленные нам образцы. Кроме того, авторы благодарят команду Центра микроскопии УКЭ (Core facility, UKE Medical School) за поддержку в проведении иммунофлуоресцентной микроскопии.
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
- Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
- Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
- Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
- Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
- Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
- Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
- Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
- Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
- de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
- Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
- Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
- Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
- Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
- Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
- Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
- Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
- Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
- Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
- Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
