تشريح وعزل أنسجة الرئة المنزوعة الخلايا الخاصة بالمنطقة
Summary
يظهر هنا بروتوكول لعزل أنسجة الرئة الخلوية الإقليمية. يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لدراسة التعقيدات في المصفوفة خارج الخلية وتفاعلات مصفوفة الخلية.
Abstract
غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل المتأخرة من مرض الرئة الحاد ، ولكن هذا محدود بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع. يعد التحقق من مناهج الهندسة الحيوية الجديدة لاستبدال الرئتين المريضة أمرا ضروريا لتحسين بقاء المريض على قيد الحياة وتجنب المضاعفات المرتبطة بمنهجيات الزرع الحالية. يتضمن النهج البديل استخدام رئتين كاملتين منزوعتين للخلايا تفتقر إلى المكونات الخلوية التي عادة ما تكون سبب الرفض الحاد والمزمن. نظرا لأن الرئة عضو معقد ، فمن المهم فحص مكونات المصفوفة خارج الخلية لمناطق معينة ، بما في ذلك الأوعية الدموية والممرات الهوائية والأنسجة السنخية. الغرض من هذا النهج هو إنشاء طرق بسيطة وقابلة للتكرار يمكن للباحثين من خلالها تشريح وعزل الأنسجة الخاصة بالمنطقة من الرئتين المنزوع الخلايا بالكامل. تم وضع البروتوكول الحالي لرئتي الخنازير والإنسان ، ولكن يمكن تطبيقه على الأنواع الأخرى أيضا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تحديد أربع مناطق من الأنسجة: مجرى الهواء والأوعية الدموية والحويصلات الهوائية وأنسجة الرئة السائبة. يسمح هذا الإجراء بشراء عينات من الأنسجة التي تمثل بدقة أكبر محتويات أنسجة الرئة منزوعة الخلايا بدلا من طرق التحليل السائبة التقليدية.
Introduction
أمراض الرئة ، بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، والتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والتليف الكيسي (CF) ، لا تزال حاليا بدون علاج1،2،3،4. غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل اللاحقة ، ولكن هذا يظل خيارا محدودا بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع3،5،6. على هذا النحو ، هناك حاجة ماسة لاستراتيجيات علاج جديدة. أحد الأساليب الواعدة في الهندسة الحيوية التنفسية هو تطبيق السقالات المشتقة من الأنسجة المحضرة من أنسجة الرئة الأصلية منزوعة الخلايا. نظرا لأن سقالات الرئة الكاملة اللاخلوية تحتفظ بالكثير من تعقيد تكوين المصفوفة خارج الخلية الأصلية (ECM) والنشاط الحيوي ، فقد تمت دراستها بشكل مكثف لهندسة الأعضاء الكاملة وكنماذج محسنة لدراسة آليات أمراض الرئة7،8،9،10. في موازاة ذلك ، هناك اهتمام متزايد باستخدام الأنسجة منزوعة الخلايا من أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الرئتين ، كهلاميات مائية وركائز أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM في نماذج زراعة الأنسجة العضوية وغيرها11،12،13،14،15،16،17. توفر هذه النماذج أكثر صلة من الركائز المتاحة تجاريا ، مثل Matrigel ، المشتقة من مصادر الورم. ومع ذلك، فإن المعلومات المتعلقة بالهلاميات المائية المشتقة من الرئة البشرية محدودة نسبيا في الوقت الحاضر. لقد وصفنا سابقا الهلاميات المائية المشتقة من رئتي الخنازير منزوعة الخلايا وميزنا خصائصها الميكانيكية والمادية ، بالإضافة إلى إثبات فائدتها كنماذج لزراعة الخلايا18,19. قام تقرير حديث بتفصيل التوصيف الميكانيكي واللزج الأولي للهلاميات المائية المشتقة من رئتي الإنسان الطبيعية والمريضة (COPD ، IPF)20. لقد قدمنا أيضا بيانات أولية تميز محتوى الجليكوزامينوجليكان في الرئتين البشرية الطبيعية ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، بالإضافة إلى قابليتها للتطبيق لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM11.
توضح هذه الأمثلة قوة استخدام ECMs الرئة البشرية منزوعة الخلايا لأغراض التحقيق. ومع ذلك ، فإن الرئة عضو معقد ، ويختلف كل من الهيكل والوظيفة في مناطق مختلفة من الرئة ، بما في ذلك تكوين ECM وخصائص أخرى مثل الصلابة21,22. على هذا النحو ، من المهم دراسة ECM في مناطق فردية من الرئة ، بما في ذلك القصبة الهوائية والممرات الهوائية الكبيرة ، والممرات الهوائية متوسطة الحجم والصغيرة ، والحويصلات الهوائية ، وكذلك الأوعية الدموية الكبيرة والمتوسطة الحجم والصغيرة. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتشريح رئتي الإنسان والخنازير منزوعة الخلايا وبالتالي عزل كل من تلك المناطق التشريحية. وقد سمح ذلك بتحليل تفاضلي مفصل لمحتوى البروتين الإقليمي في كل من الرئتين الطبيعية والمريضة21.
Protocol
Representative Results
Discussion
كثيرا ما تستخدم الأنسجة المنزوعة الخلايا من البشر والأنواع الأخرى كمواد حيوية لدراسة تكوين ECM وكذلك تفاعلات الخلايا ECM في نماذج الاستزراع خارج الجسم الحي ، بما في ذلك الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد12،13. على غرار الأعضاء الأخرى ، تم استخدام الرئتين من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون خدمات تشريح الجثة UVM لشراء الرئة البشرية ودكتوراه روبرت بوليوت لمساهماتهم في تقنيات التشريح الشاملة. تم دعم هذه الدراسات بواسطة R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
