Modellering af hjernetumorer in vivo ved hjælp af elektroporationsbaseret levering af plasmid-DNA, der repræsenterer patientmutationssignaturer
Summary
Brug af en immunokompetent, autokton tumormodel drevet af almindelige patientmutationer til præklinisk test er kritisk for immunterapeutisk testning. Denne protokol beskriver en metode til at generere hjernetumormusemodeller ved hjælp af elektroporationsbaseret levering af plasmid-DNA, der repræsenterer almindelige patientmutationer, hvilket giver en nøjagtig, reproducerbar og konsistent musemodel.
Abstract
Tumormodeller er afgørende for den prækliniske test af hjernetumorer med hensyn til at udforske nye, mere effektive behandlinger. Med betydelig interesse for immunterapi er det endnu mere kritisk at have en konsistent, klinisk relevant, immunkompetent musemodel til at undersøge tumor- og immuncellepopulationerne i hjernen og deres respons på behandlingen. Mens de fleste prækliniske modeller anvender ortopisk transplantation af etablerede tumorcellelinjer, giver modelleringssystemet, der præsenteres her, mulighed for en “personlig” repræsentation af patientspecifikke tumormutationer i en gradvis, men effektiv udvikling fra DNA-konstruktioner indsat i delende neurale forløberceller (NPC’er) in vivo. DNA-konstruktioner indeholder mosaikanalysen med metoden med dobbelt-rekombinase-medieret kassetteudveksling (MADR), der muliggør enkeltkopi, somatisk mutagenese af drivermutationer. Ved hjælp af nyfødte museunger mellem fødslen og 3 dage gamle målrettes NPC’er ved at drage fordel af disse delende celler, der forer de laterale ventrikler. Mikroinjektion af DNA-plasmider (fx MADR-afledte, transposoner, CRISPR-rettet sgRNA) i ventriklerne efterfølges af elektroporation ved hjælp af padle, der omgiver hovedets rostrale region. Ved elektrisk stimulering optages DNA’et i de delende celler med potentiale til integration i genomet. Anvendelsen af denne metode er med succes blevet demonstreret ved udvikling af både pædiatriske og voksne hjernetumorer, herunder den mest almindelige maligne hjernetumor, glioblastom. Denne artikel diskuterer og demonstrerer de forskellige trin i udviklingen af en hjernetumormodel ved hjælp af denne teknik, herunder proceduren for bedøvelse af unge museunger, til mikroinjektion af plasmidblandingen efterfulgt af elektroporation. Med denne autoktone, immunkompetente musemodel vil forskere have mulighed for at udvide prækliniske modelleringsmetoder i bestræbelserne på at forbedre og undersøge effektiv kræftbehandling.
Introduction
Murine hjernetumor modeller er afgørende for at forstå mekanismerne for hjernetumor dannelse og behandling. Nuværende modeller omfatter typisk hurtigt producerede subkutane eller ortotopiske transplantationer af almindeligt anvendte tumorcellelinjer baseret på et begrænset antal drivermutationer eller patientafledte xenograftmodeller ved hjælp af immundefekte mus, der forhindrer korrekte immunterapistudier 1,2,3,4. Derudover kan disse prækliniske resultater føre til falske positive, idet sådanne modeller kan udvise dramatiske, ofte helbredende virkninger som reaktion på terapi, men dette oversætter ikke til klinikken 2,5,6,7. At have evnen til hurtigt at producere genetisk manipulerede prækliniske musemodeller, der i højere grad afspejler patientens mutationssignaturer, er afgørende for at forbedre validiteten af prækliniske resultater.
Elektroporation (EP)-baseret levering af DNA-plasmider for at inducere både tab af funktion (LOF) og forstærkning af funktion (GOF) mutationer muliggør generering af sådanne modeller. Vi udviklede en metode til en endnu mere præcis repræsentation af GOF drivermutationer kaldet mosaikanalyse med dual-recombinase-medieret kassetteudveksling eller MADR8. Denne metode giver mulighed for ekspression af et gen (eller gener) af interesse på en kontrolleret, locus-specifik måde i somatiske celler8. I kombination med andre molekylære værktøjer, såsom grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR), kan forskellige patientmutationer kombineres for at udvikle musehjernetumormodeller. Denne metode er blevet anvendt til forskellige pædiatriske hjernetumorer, herunder gliomer og ependymomas8, samt voksne hjernetumormodeller, såsom glioblastom (GBM).
Mens EP-metoden til tumormodellering ikke er så almindelig som en transplantation, viser følgende hidtil letheden og den høje reproducerbarhed af dette modelleringssystem. mTmG-mus anvendes til indsættelse af MADR-plasmid-DNA 8,9. Dette system giver mulighed for rekombination af loxP- og Flp-rekombinasemålsteder (FRT) placeret på Rosa26-locus til efterfølgende indsættelse af donor-DNA-plasmidet (dvs. GOF-gen af interesse)8,9. Følgende protokol demonstrerer ligefremheden af denne metode efter flittig praksis og evnen til at udvikle musehjernetumormodeller på en autokton, konsekvent måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporationsbaseret levering af plasmid-DNA muliggør in vivo-anvendelse af molekylærbiologi, svarende til den, der anvendes i genetisk manipulerede musemodeller, men med hastigheden, lokaliseringen og effektiviteten af viral transduktion 8,13,14. Med sidstnævnte kommer imidlertid sikkerhedsproblemer såvel som immunresponser. Vi har vist i vores modelleringssystem ved hjælp af EP-levering af plasmid-DNA, at der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gi Bum Kim for den immunfluorescerende farvning og billeder. Vi takker også Emily Hatanaka, Naomi Kobritz og Paul Linesch for nyttige råd om protokollen.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
