रोगी उत्परिवर्तन हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व करने वाले प्लास्मिड डीएनए के इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण का उपयोग करके विवो में ब्रेन ट्यूमर मॉडलिंग
Summary
प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए सामान्य रोगी उत्परिवर्तन द्वारा संचालित एक इम्यूनोसक्षम, ऑटोक्थोनस ट्यूमर मॉडल का उपयोग करना इम्यूनोथेराप्यूटिक परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल प्लास्मिड डीएनए के इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण का उपयोग करके मस्तिष्क ट्यूमर माउस मॉडल उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है जो सामान्य रोगी उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार एक सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत माउस मॉडल प्रदान करता है।
Abstract
ट्यूमर मॉडल नए, अधिक प्रभावोत्पादक उपचारों की खोज के मामले में मस्तिष्क ट्यूमर के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं। इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण रुचि के साथ, मस्तिष्क में ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक सुसंगत, चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक, इम्यूनोसक्षम माउस मॉडल होना और भी महत्वपूर्ण है। जबकि अधिकांश प्रीक्लिनिकल मॉडल स्थापित ट्यूमर सेल लाइनों के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण का उपयोग करते हैं, यहां प्रस्तुत मॉडलिंग सिस्टम विवो में विभाजित तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में डाले गए डीएनए संरचनाओं से क्रमिक, अभी तक प्रभावी विकास में रोगी-विशिष्ट ट्यूमर उत्परिवर्तन के “व्यक्तिगत” प्रतिनिधित्व की अनुमति देता है। डीएनए संरचनाओं में दोहरे-रिकोम्बिनेस-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (एमएडीआर) विधि के साथ मोज़ेक विश्लेषण की सुविधा होती है, जो ड्राइवर उत्परिवर्तन के एकल-प्रतिलिपि, दैहिक म्यूटेनेसिस की अनुमति देता है। जन्म और 3 दिन की उम्र के बीच नवजात माउस पिल्ले का उपयोग करके, एनपीसी को पार्श्व वेंट्रिकल्स को अस्तर करने वाली इन विभाजित कोशिकाओं का लाभ उठाकर लक्षित किया जाता है। वेंट्रिकल्स में डीएनए प्लास्मिड (जैसे, एमएडीआर व्युत्पन्न, ट्रांसपोसन, सीआरआईएसपीआर-निर्देशित एसजीआरएनए) के माइक्रोइंजेक्शन के बाद पैडल का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाता है जो सिर के रोस्ट्रल क्षेत्र को घेरता है। विद्युत उत्तेजना पर, डीएनए को विभाजित कोशिकाओं में ले जाया जाता है, जिसमें जीनोम में एकीकृत होने की क्षमता होती है। इस पद्धति का उपयोग बाल चिकित्सा और वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर दोनों को विकसित करने में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है, जिसमें सबसे आम घातक मस्तिष्क ट्यूमर, ग्लियोब्लास्टोमा शामिल है। यह लेख इस तकनीक का उपयोग करके एक मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल विकसित करने के विभिन्न चरणों पर चर्चा करता है और प्रदर्शित करता है, जिसमें युवा माउस पिल्ले को एनेस्थेटाइज करने की प्रक्रिया, प्लास्मिड मिश्रण के माइक्रोइंजेक्शन, इसके बाद इलेक्ट्रोपोरेशन शामिल है। इस ऑटोकॉन्थोनस, इम्यूनोसक्षम माउस मॉडल के साथ, शोधकर्ताओं के पास प्रभावोत्पादक कैंसर उपचार को बेहतर बनाने और जांचने के प्रयासों में प्रीक्लिनिकल मॉडलिंग दृष्टिकोण का विस्तार करने की क्षमता होगी।
Introduction
मस्तिष्क ट्यूमर के गठन और उपचार के तंत्र को समझने के लिए मुराइन ब्रेन ट्यूमर मॉडल महत्वपूर्ण हैं। वर्तमान मॉडल में आमतौर पर आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ट्यूमर सेल लाइनों के तेजी से उत्पादित चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण शामिल होते हैं, जो सीमित संख्या में ड्राइवर म्यूटेशन या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल पर आधारित होते हैं, इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों का उपयोग करते हुए जो उचित इम्यूनोथेरेपी अध्ययनमें बाधा डालते हैं 1,2,3,4. इसके अतिरिक्त, ये प्रीक्लिनिकल परिणाम झूठे सकारात्मक हो सकते हैं, जिसमें ऐसे मॉडल चिकित्सा के जवाब में नाटकीय, अक्सर उपचारात्मक प्रभाव प्रदर्शित कर सकते हैं, लेकिन यह क्लिनिक 2,5,6,7 में अनुवाद नहीं करता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल का तेजी से उत्पादन करने की क्षमता होना जो रोगी उत्परिवर्तन हस्ताक्षर के अधिक प्रतिबिंबित होते हैं, प्रीक्लिनिकल परिणामों की वैधता में सुधार के लिए अनिवार्य है।
डीएनए प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन (ईपी)-आधारित वितरण कार्य के नुकसान (एलओएफ) और गेन ऑफ फंक्शन (जीओएफ) उत्परिवर्तन दोनों को प्रेरित करने के लिए ऐसे मॉडल ों की पीढ़ी की अनुमति देता है। हमने जीओएफ ड्राइवर म्यूटेशन के और भी सटीक प्रतिनिधित्व के लिए एक विधि विकसित की है जिसे दोहरे-रिकॉम्बिनेस-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज, या एमएडीआर8 के साथ मोज़ेक विश्लेषण कहा जाता है। यह विधि दैहिककोशिकाओं में एक नियंत्रित, लोक-विशिष्ट तरीके से रुचि के जीन (या जीन) की अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। अन्य आणविक उपकरणों के साथ संयोजन में, जैसे कि नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर), माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल विकसित करने के लिए विभिन्न रोगी उत्परिवर्तन ों को जोड़ा जा सकता है। इस विधि का उपयोग विभिन्न बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर के लिए किया गया है, जिसमें ग्लियोमास और एपेंडिमोमास8, साथ ही वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल, जैसे ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) शामिल हैं।
जबकि ट्यूमर मॉडलिंग की ईपी विधि एक प्रत्यारोपण के रूप में आम नहीं है, निम्नलिखित इस मॉडलिंग प्रणाली की आसानी और उच्च प्रजनन क्षमता को दर्शाता है। एमटीएमजी चूहों का उपयोग एमएडीआर-प्लास्मिड डीएनए 8,9 के सम्मिलन के लिए किया जाता है। यह प्रणाली दाता डीएनए प्लास्मिड (यानी, जीओएफ जीन ऑफ इंटरेस्ट) 8,9 के बाद के सम्मिलन के लिए रोसा 26 लोकस में स्थित लॉक्सपी और एफएलपी रिकोम्बिनेस टारगेट (एफआरटी) साइटों के पुनर्संयोजन की अनुमति देती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल मेहनती अभ्यास के बाद इस विधि की सीधेपन को प्रदर्शित करता है, और माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल को एक स्वचालित, सुसंगत तरीके से विकसित करने की क्षमता को दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण आणविक जीव विज्ञान के विवो उपयोग के लिए अनुमति देता है, जैसा कि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में उपयोग किया जाता है, लेकिन वायरल ट्रांसडक्शन …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और छवियों के लिए गी बम किम को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोटोकॉल पर उपयोगी सलाह के लिए एमिली हटनाका, नाओमी कोब्रिट्ज़ और पॉल लिनेश को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
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