Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG
Summary
Здесь мы подробно описываем протокол количественного определения длины теломер с использованием нерадиоактивного хемилюминесцентного детектирования с акцентом на оптимизацию различных параметров производительности набора для анализа длины теломер TAGGG, таких как буферные количества и концентрации зонда.
Abstract
Теломеры представляют собой повторяющиеся последовательности, которые присутствуют на концах хромосом; Их укорочение является характерной особенностью соматических клеток человека. Укорочение происходит из-за проблемы с репликацией концов и отсутствия фермента теломеразы, который отвечает за поддержание длины теломер. Интересно, что теломеры также укорачиваются в ответ на различные внутренние физиологические процессы, такие как окислительный стресс и воспаление, на которые могут влиять внеклеточные агенты, такие как загрязняющие вещества, инфекционные агенты, питательные вещества или радиация. Таким образом, длина теломер служит отличным биомаркером старения и различных физиологических параметров здоровья. Набор для анализа длины теломер TAGGG используется для количественного определения средней длины теломер с использованием анализа фрагмента рестрикции теломер (TRF) и обладает высокой воспроизводимостью. Однако это дорогостоящий метод, и из-за этого он обычно не используется для больших чисел выборки. Здесь мы описываем подробный протокол для оптимизированного и экономически эффективного измерения длины теломер с использованием Southern Blots или TRF-анализа и нерадиоактивного детектирования на основе хемилюминесценции.
Introduction
Теломеры – это повторяющиеся последовательности ДНК, присутствующие на концах хромосом. Они имеют тандемные повторы TTAGGG и поддерживают целостность генома, защищая хромосому как от износа, так и от проблемы репликации конца, что означает, что часть 3′-навеса не может быть реплицирована ДНК-полимеразой 1,2. Короткие теломеры приводят к хромосомным аномалиям в клетках, из-за чего клетки постоянно останавливаются на стадии, называемой репликативным старением3. Короткие теломеры также вызывают множество других проблем, таких как дисфункция митохондрий 4,5 и клеточная дисфункция.
Теломерные повторы ДНК теряются по мере деления клетки со средней потерей от 25 до 200.н. в год 6, что приводит к клеточному старению после определенного количества делений6. Старение связано с более высокой частотой сопутствующих заболеваний, которая отмечается укорочением длины теломер7. Анализ фрагментов рестрикции теломер (TRF), описанный Мендером, является очень дорогим методом8. Из-за этого он не применяется при количественном определении длины теломер в большинстве исследований.
В настоящее время в большинстве эпидемиологических исследований используются количественные измерения длины теломер на основе полимеразной цепной реакции (кПЦР). Однако метод на основе кПЦР является относительным методом измерения, поскольку он измеряет соотношение между теломерами и продуктами амплификации генов одной копии, а не абсолютную длину теломер. Измерение длины теломер с использованием протокола TRF является методом золотого стандарта, поскольку он может измерять распределение длины теломер в образце, а измерения могут быть выражены в абсолютных значениях в килобазах (кб). Однако его использование ограничено, поскольку он громоздкий, трудоемкий и дорогостоящий. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для измерения длины теломер с использованием TRF на основе хемилюминесценции.
TRF-анализ включает семь основных этапов: 1) культивирование клеток для выделения геномной ДНК, 2) выделение геномной ДНК с использованием метода фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (P:C:I), 3) рестрикционное переваривание геномной ДНК, 4) электрофорез в агарозном геле, 5) Южное блоттинг фрагмента ДНК рестрикционного расщепления, 6) гибридизация и детектирование с помощью хемилюминесценция – иммобилизованный зонд теломер визуализируется высокочувствительным хемилюминесцентным субстратом для щелочной фосфатазы, динатриевым 2-хлор-5-(4-метоксиспиро[1,2-диоксетан-3,2′-(5-хлортрицикло[3.3.1.13.7]декан])-4-ил]-1-фенилфосфатом (CDP-Star)-и 7) для получения информации о средней длине теломер и дальности из этих теломерных мазков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы подробно описываем процедуру нерадиоактивного, основанного на хемилюминесценции метода измерения длины теломер с использованием блоттинга Саузерна. Протокол был протестирован, чтобы обеспечить разумное использование нескольких реагентов без ущерба для качества результатов. Буф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить г-жу Прачи Шах за помощь в оптимизации протокола. Мы хотели бы поблагодарить доктора Маноджа Гарга за предоставление клеточной линии рака яичников A2780. EK поддерживается исследовательским грантом Департамента биотехнологии (No BT / RLF / Re-entry / 06/2015), Департамента науки и технологий (ECR / 2018 / 002117) и грантом NMIMS Seed (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
