Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG
Summary
Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per quantificare la lunghezza dei telomeri utilizzando la rilevazione chemiluminescente non radioattiva, con particolare attenzione all’ottimizzazione di vari parametri prestazionali del kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG, come le quantità tampone e le concentrazioni della sonda.
Abstract
I telomeri sono sequenze ripetitive presenti alle estremità cromosomiche; Il loro accorciamento è una caratteristica delle cellule somatiche umane. L’accorciamento si verifica a causa di un problema con la replicazione finale e l’assenza dell’enzima telomerasi, che è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri. È interessante notare che i telomeri si accorciano anche in risposta a vari processi fisiologici interni, come lo stress ossidativo e l’infiammazione, che possono essere influenzati a causa di agenti extracellulari come inquinanti, agenti infettivi, nutrienti o radiazioni. Pertanto, la lunghezza dei telomeri funge da eccellente biomarcatore dell’invecchiamento e di vari parametri fisiologici di salute. Il kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG viene utilizzato per quantificare le lunghezze medie dei telomeri utilizzando il test TRF (telomere restriction fragment) ed è altamente riproducibile. Tuttavia, è un metodo costoso e, a causa di ciò, non viene utilizzato di routine per grandi numeri di campioni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una misurazione ottimizzata ed economica della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blots o analisi TRF e rilevamento basato sulla chemiluminescenza non radioattiva.
Introduction
I telomeri sono le sequenze ripetitive di DNA presenti alla fine dei cromosomi. Hanno ripetizioni in tandem di TTAGGG e mantengono l’integrità del genoma proteggendo il cromosoma sia dallo sfilacciamento che dal problema della replicazione finale, il che significa che parte della sporgenza 3′ non può essere replicata dalla DNA polimerasi 1,2. I telomeri corti portano ad anomalie cromosomiche nelle cellule, a causa delle quali le cellule vengono arrestate permanentemente in uno stadio chiamato senescenza replicativa3. I telomeri corti causano anche una miriade di altri problemi, come la disfunzione mitocondriale 4,5 e la disfunzione cellulare.
Le ripetizioni telomeriche del DNA vengono perse man mano che la cellula si divide, con una perdita media da 25 a 200 bp all’anno 6, con conseguente senescenza cellulare dopo un certo numero di divisioni6. L’invecchiamento è associato a una maggiore frequenza di comorbidità, che è caratterizzata da un accorciamento della lunghezza dei telomeri7. L’analisi dei frammenti di restrizione dei telomeri (TRF), come descritto da Mender, è un metodo molto costoso8. Per questo motivo, non viene implementato durante la quantificazione della lunghezza dei telomeri nella maggior parte degli studi.
Attualmente, la maggior parte degli studi epidemiologici impiega misurazioni quantitative basate sulla reazione a catena della polimerasi (qPCR) della lunghezza dei telomeri. Tuttavia, il metodo basato su qPCR è un metodo di misurazione relativo, in quanto misura il rapporto tra telomeri e prodotti di amplificazione genica a copia singola e non la lunghezza assoluta dei telomeri. La misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando il protocollo TRF è il metodo gold standard, in quanto può misurare la distribuzione della lunghezza dei telomeri nel campione e le misurazioni possono essere espresse in valori assoluti in kilobasi (kb). Tuttavia, il suo uso è limitato perché è ingombrante, laborioso e costoso. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando TRF basati su chemiluminescenza.
L’analisi TRF comprende sette fasi principali: 1) coltura di cellule per l’estrazione del DNA genomico, 2) estrazione del DNA genomico utilizzando il metodo fenolo:cloroformio:isoamilalcol (P:C:I), 3) digestione di restrizione del DNA genomico, 4) elettroforesi su gel di agarosio, 5) Southern blotting del frammento di DNA della digestione di restrizione, 6) ibridazione e rilevamento tramite Chemiluminescenza – La sonda telomerica immobilizzata viene visualizzata da un substrato chemiluminescente altamente sensibile per la fosfatasi alcalina, il disodio 2-cloro-5-(4-metossispiro[1,2-dioxetano-3,2′-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decano])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-e 7) per ottenere informazioni sulla lunghezza media dei telomeri e sulla gamma da questi strisci telomerici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo una procedura dettagliata per un metodo non radioattivo, basato sulla chemiluminescenza per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blotting. Il protocollo è stato testato per consentire l’uso giudizioso di diversi reagenti senza compromettere la qualità dei risultati. Il buffer di preibridazione e ibridazione può essere riutilizzato fino a cinque volte. La concentrazione enzimatica può variare tra 10-20 U per 1,5-2 μg di DNA genomico senza influenzare i risultati. Diversi altri …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la signora Prachi Shah per averci aiutato inizialmente con l’ottimizzazione del protocollo. Vorremmo ringraziare il Dr. Manoj Garg per aver fornito la linea cellulare di cancro ovarico A2780. EK è supportato da una sovvenzione di ricerca del Dipartimento di Biotecnologia (n. BT / RLF / Re-entry / 06 / 2015), Dipartimento di scienza e tecnologia (ECR / 2018 / 002117) e NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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