Denne protokollen fokuserer på alkalisk brennindusert hornhinne-neovaskularisering hos mus. Metoden genererer en reproduserbar og kontrollerbar hornhinnesykdomsmodell for å studere patologisk angiogenese og tilhørende molekylære mekanismer og for å teste nye farmakologiske midler for å forhindre hornhinde-neovaskularisering.
Korneal neovaskularisering (CoNV), en patologisk form for angiogenese, involverer veksten av blod og lymfekar i den avaskulære hornhinnen fra limbus og påvirker gjennomsiktighet og syn negativt. Alkaliforbrenning er en av de vanligste formene for okulært traume som fører til CoNV. I denne protokollen induseres CoNV eksperimentelt ved bruk av natriumhydroksidoppløsning på en kontrollert måte for å sikre reproduserbarhet. Alkalibrenningsmodellen er nyttig for å forstå patologien til CoNV og kan utvides til å studere angiogenese generelt på grunn av tilgjengeligheten, gjennomsiktigheten og tilgjengeligheten til hornhinnen. I dette arbeidet ble CoNV analysert ved direkte undersøkelse under et dissekerende mikroskop og ved immunfarging av flatmonterte hornhinner ved bruk av anti-CD31 mAb. Lymfangiogenese ble påvist på flatmonterte hornhinner ved immunfarging med anti-LYVE-1 mAb. Hornhinneødem ble visualisert og kvantifisert ved hjelp av optisk koherenstomografi (OCT). Oppsummert vil denne modellen bidra til å fremme eksisterende neovaskulariseringsanalyser og oppdage nye behandlingsstrategier for patologisk okulær og ekstraokulær angiogenese.
Hornhinnen er et avvaskulært vev som opprettholder sin gjennomsiktighet ved å etablere et angiogent privilegium 1,2. Skader på hornhinnen kan føre til betennelse og utvikling av blod og lymfeårer, samt fibrose3. Korneal neovaskularisering (CoNV) fører til synshemming og er den nest største årsaken til blindhet over hele verden4. CoNV påvirker rundt 1,4 millioner mennesker i USA per år5. CoNV kan induseres av ulike faktorer, inkludert kjemiske forbrenninger, infeksjoner, betennelse og hypoksi 3,6. Kjemiske forbrenninger er en av de vanligste okulære nødsituasjonene, og de står for ca 13,2% av okulære traumer og krever umiddelbar vurdering og behandling7. Kjemiske forbrenninger kan være alkali- eller syreforbrenninger, men alkaliforbrenninger forårsaker mer alvorlig skade, da alkali trenger dypere inn i vevet8.
Musemodeller av alkaliforbrenning er mye brukt til å studere CoNV og sårheling. Sammenlignet med hornhinnen lommeangiogenese modell 9,10, er alkaliforbrenningsmodeller relativt enkle å lage og kan også brukes til å studere hornhinnebetennelse, fibrose og epitelial spredning. Disse modellene er også nærmere knyttet til kliniske kjemiske forbrenninger enn hornhindesuturmodeller av angiogenese11. Med alkaliforbrenning utvikler den ellers avaskulære hornhinnen blodkar på grunn av betennelse og ubalanse i anti-angiogene og pro-angiogene faktorer 1,2. Ulempene med korneal alkaliforbrenningsmodeller er vanskelighetene med å kontrollere området og alvorlighetsgraden av alkaliforbrenningen, variasjonen i hornhinde-neovaskularisering og utilsiktet forbrenning av tilstøtende vev på grunn av overflødig alkaliløsning. Hensikten med denne studien er å beskrive en kontrollert hornhinnealkaliforbrenningsmodell hos mus ved bruk av filterpapir som er fordypet i natriumhydroksidoppløsning. Denne modellen kan brukes til å studere angiogene faktorer, anti-angiogene terapeutiske reagenser og andre faktorer og reagenser som kan modulere betennelse og fibrose.
Hornhinnen er et utmerket vev for å studere angiogenese og betennelse fordi den er tilgjengelig og avaskulær, noe som betyr at neovaskularisering enkelt kan oppdages og dokumenteres. Hornhinneforbrenning hos kaniner, rotter og mus har blitt brukt til å studere hornhinneangiogenese, betennelse og opasitet, sårdannelse, perforering av hornhinnen og fibrose15,16,17. Videre er musemodellen av hornhinneforbrenning verdifull for å teste ulike terapeutiske strategier for angiogenese og betennelse fordi mus har et immunsystem som er nært knyttet til det hos mennesker18. Tilgjengeligheten av teknikker for å genetisk manipulere musegenomet gjør også arten til et utmerket valg for denne typen studier19. Utfordringen i denne forskningen har vært å utvikle en metode for hornhinneforbrenning som gir konsistent, reproduserbar patofysiologi.
Alkalibrenningsmodellen er spesielt nyttig for farmakologisk screening av legemidler som modulerer angiogenese, betennelse og fibrose. De minimale kravene til reagenser og ressurser, enkelheten ved å utføre alkaliforbrenningen, og fordelene med protokollens korte varighet og direkte observasjon av resultatene, gjør alkaliforbrenning på musehornhinnen til et primært valg for farmakologisk legemiddelscreening. Noen forholdsregler bør imidlertid vurderes når denne prosedyren utføres for å sikre konsistens og reproduserbarhet. For det første må filterpapiret plasseres i midten av hornhinnen for å unngå å brenne andre områder av øyet, spesielt limbus, øyelokk og bindehinne; For det andre bør volumet og konsentrasjonen av NaOH være hensiktsmessig for å oppnå konsistente resultater fra alkaliforbrenningen på hornhinnen. Filteret må ikke være dryppende vått, men skal ha blitt dynket i NaOH-oppløsningen. Filterstørrelsen og filtertypen og normaliteten og volumet av løsningen som brukes i denne metoden er optimalisert for å unngå overløp av NaOH. Ved hjelp av en annen størrelse filterpapir eller et høyere eller lavere volum av NaOH ville føre til inkonsekvenser i neovaskularisering. For det tredje er det viktig å forhindre at NaOH-oppløsningen absorberer CO2 i romluften ved umiddelbart å stramme oppløsningens slangehette etter bruk og redusere forholdet mellom luft og oppløsning. Det må tas hensyn til bruk av friske alkaliske løsninger for å forhindre inkonsekvenser i neovaskulariseringen og for å unngå hornhinnenesår. Endelig er omfattende vask av all NaOH-løsningen fra øyet og bindehinnen med saltvann nødvendig for å forhindre ytterligere skade på hornhinnen og omkringliggende vev i øyet. Grundig vask av hornhinnen og tilstøtende vev vil også forhindre symblepharon.
Protokollen beskrevet her er en effektiv og pålitelig metode for å studere patofysiologien av hornhindeangiogenese. Denne protokollen kan videre brukes til å studere hornhinnebetennelse, fibrose og sårheling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, og et ubegrenset institusjonelt tilskudd fra Research to Prevent Blindness (RPB) til Institutt for oftalmologi, Baylor College of Medicine. WL er støttet av The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.
0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
Forceps | Roboz | RS-4905 | |
Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
PBS | Gibco | 20012-027 | |
Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
Saline | Henry Schein | 1531042 | |
SMZ125 | Nikon Instruments | ||
Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |