Uma Técnica Aprimorada para Detecção de Trimetilamina em Medicina Derivada de Animais por Cromatografia Gasosa Headspace-Espectrometria de Massas em Tandem Quadrupolo
Summary
Aqui, um método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) adequado para a determinação de trimetilamina (TMA) em medicamentos derivados de animais é descrito. O protocolo inclui pré-tratamento da amostra, tratamento com headspace, condições de análise, validação metodológica e determinação de TMA em medicamentos derivados de animais.
Abstract
Os medicamentos de origem animal têm características distintas e efeitos curativos significativos, mas a maioria deles tem um odor de peixe óbvio, resultando na baixa adesão dos pacientes clínicos. A trimetilamina (TMA) é um dos principais componentes de odor de peixe na medicina de origem animal. É difícil identificar com precisão a TMA usando o método de detecção existente devido ao aumento da pressão no frasco para injetáveis de headspace causado pela rápida reação ácido-base após a adição de lixívia, o que faz com que a TMA escape do frasco para injetáveis de headspace, atrasando o progresso da pesquisa do odor de peixe da medicina derivada de animais. Neste estudo, propusemos um método de detecção controlada que introduziu uma camada de parafina como camada de isolamento entre o ácido e a soda cáustica. A taxa de produção de TMA pode ser efetivamente controlada pela liquefação lenta da camada de parafina através do aquecimento termostático do forno. Este método apresentou linearidade satisfatória, experimentos de precisão e recuperações com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade. Prestou apoio técnico para a desodorização de medicamentos derivados de animais.
Introduction
O tratamento de doenças humanas utilizando produtos derivados de partes animais e/ou seus subprodutos (aqui referidos como medicamentos derivados de animais) está recebendo atenção crescente. Eles desempenham um papel importante no tratamento de câncer, doenças cardiovasculares, cirrose hepática, mastite e outras doenças, com as vantagens de um forte efeito, pequena dosagem e eficácia clínica significativa e específica. No entanto, medicamentos de origem animal geralmente apresentam odor proeminente de peixe, o que afeta sobremaneira a adesão dos pacientes, sendo especialmente desfavoráveis para crianças 1,2. O odor de peixe provém principalmente das proteínas, aminoácidos, gorduras e outras substâncias contidas no medicamento, que são decompostas através da oxidação de ácidos graxos, degradação de aminoácidos e outras formas de produzir uma variedade de substâncias com odor de peixe 2,3,4. Dentre eles, a trimetilamina (TMA) é um gás volátil com odor de peixe que existe amplamente em alimentos de origem animal em decomposição ou apodrecidos5.
Até o momento, cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida (CL), cromatografia iônica, espectrofotometria, cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) e métodos sensores têm sido comumente utilizados para detectar TMA no ambiente, alimentos e urina 6,7,8,9. Tendo em vista a baixa contaminação da coluna GC e do sistema de injeção, bem como a alta sensibilidade, reprodutibilidade e baixo limite de detecção (0,1-1 mg/kg), o método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas (HS-GC-MS) foi preferido para análise biológica e de alimentos8. Atualmente, apenas a China estabeleceu um padrão nacional para TMA em alimentos, e HS-GC-MS é o primeiro método no padrão GB5009.179-201610. Portanto, o método HS-GC-MS acima foi selecionado para detectar TMA em medicina derivada de animais. No estágio inicial, nosso grupo de pesquisa descobriu que o padrão de detecção de HS-GC-MS para TMA em alimentos poderia detectar o odor de peixe em vários medicamentos derivados de animais. Combinado com os resultados dos estudos11,12, pôde-se provar que a MAT é a substância-chave comum do odor de peixe em medicamentos derivados de animais. No entanto, verificou-se que a reprodutibilidade dos resultados experimentais foi pobre, havendo problemas como escape de ATM e baixa estabilidade, o que não pôde ser verificado pela metodologia. Isso pode ser devido ao fato de que a lixívia foi injetada no frasco do headspace e a rápida reação ácido-base levou ao aumento da pressão no frasco, escapando assim da TMA do poro de injeção, impedindo a detecção estável e precisa da MAT. Portanto, este estudo propôs um método aprimorado de detecção por cromatografia gasosa em headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) para resolver esses problemas.
O protocolo melhora o pré-tratamento da amostra separando os reagentes ácido-base no pré-tratamento com a ajuda de parafina sólida, um bom material de mudança de fase sólido-líquido. Como a parafina se liquefez lentamente com o aumento da temperatura do forno termostático, a TMA também foi liberada lentamente no frasco do headspace selado, evitando o aumento de pressão causado pela violenta e rápida reação ácido-base e garantindo uma detecção estável e precisa da TMA. Além disso, a injeção de headspace combinada com os modos de monitoramento de reação múltipla (MRM) em GC-MS/MS efetivamente suprimiu a interferência química da matriz e garantiu a confiabilidade dos resultados. Os resultados da validação metodológica comprovaram que a linearidade, o teste de precisão e a taxa de recuperação do método de detecção aprimorado podem atender aos requisitos, com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os medicamentos de origem animal provêm de todo o corpo, órgãos ou tecidos, produtos fisiológicos ou patológicos, excreções ou secreções e produtos transformados de animais. A TMA é uma importante fonte de odor de peixe em medicamentos derivados de animais; é uma substância malcheirosa típica com um limiar olfatório muito baixo (0,000032 × 10-6 V/V) e um forte odor de peixe13. Atualmente, o método HS-GC-MS comumente usado não pode detectar TMA em medicamentos derivados …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82173991) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022YFS0442).
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
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