Оптимизация процедуры выращивания безмикробных ос
Summary
Эмбрионы осы Nasonia препарировали из куколок Lucillia sericata после паразитирования в течение 12-24 ч и промывали спиртом и 10% раствором гипохлорита натрия для получения безмикробных эмбрионов. После выращивания безмикробных эмбрионов и снабжения их средой для выращивания Nasonia для роста и развития in vitro были получены взрослые особи Nasonia без микробов.
Abstract
Технология асептического выращивания – это метод культивирования насекомых в стерильных или почти стерильных условиях, который позволяет эффективно исключить влияние внешних микроорганизмов на микробиоту насекомых и тем самым способствовать быстрому развитию исследований микробиоты насекомых. Nasonia (род ос) – это паразитическое насекомое-оса, которое имеет много преимуществ, таких как короткая продолжительность жизни, высокая генетическая изменчивость, простота в эксплуатации и т. д., и широко используется в качестве модельной системы насекомых. В отличие от лечения антибиотиками, которое может только уменьшить количество микроорганизмов у животных, методы асептического выращивания могут контролировать как состав, так и количество микроорганизмов у животных, что еще больше облегчает изучение взаимодействий хозяина и микроба. Однако предыдущие версии среды для выращивания Nasonia (NRM) имеют некоторые дефекты и проблемы, такие как сложный и трудоемкий процесс приготовления, легкое загрязнение бактериями или грибками и короткое время хранения. Таким образом, данное исследование решает эти проблемы за счет оптимизации инструментов, используемых в процессе подготовки NRM, условий хранения и соотношения компонентов. Оптимизированная среда может обеспечить хранение при -20 °C в течение не менее 3 месяцев и исключить возможность загрязнения NRM во время кормления стерильных ос. Это еще больше улучшает выживаемость и уровень здоровья асептической Nasonia, что важно для использования Nasonia в качестве модели для микробных исследований.
Introduction
Безмикробные животные – это животные, у которых нет обнаруживаемых живых микроорганизмов и паразитов1. Эмбрионы, не содержащие зародышей, могут быть получены путем вскрытия матери в асептических условиях и впоследствии выращены в барьерных системах2. Такие животные могут быть использованы для изучения воздействия микроорганизмов на животных, таких как кишечная микробиота, иммунная система и метаболизм1. С помощью определенных технических средств многие насекомые и даже млекопитающие могут быть стерильны 3,4. Безмикробные животные играют уникальную роль и широко используются в различных аспектах микробиологических исследований5. Например, использование безмикробных ос Nasonia показало, что микроорганизмы могут помочь хозяевам адаптироваться к новым условиям в условиях длительного экзогенного стрессаокружающей среды 6,7.
Паразитоиды Nasonia – это мелкие паразитические осы, которые впрыскивают свои яйца в куколок мух4. Известно четыре вида Nasonia, в том числе Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti и Nasonia oneida8. N. vitripennis можно найти по всему миру, в то время как три других вида имеют ограниченный ареал в Северной Америке4. Паразитоидные осы Nasonia считаются идеальными модельными насекомыми из-за их характеристик, таких как простота выращивания, короткий цикл размножения, секвенированный геном и длительная диапауза 8,9. Их можно использовать для изучения различных аспектов эволюции насекомых, генетики, развития, поведения и симбиоза10. Кроме того, паразитоидные осы Nasonia также могут помочь в борьбе с вредными мухами в сельском хозяйстве и болезнями11. Успешное создание стерильной системы насекомых включает в себя два основных этапа: (1) стерилизацию эмбрионов и (2) предоставление стерильной пищи личинкам in vitro. Чтобы получить стерильную пищу, Брукер и Борденштейн 12 разработали среду для выращивания Nasonia (NRMv1) в 2012 году с использованием химических веществ, таких как антибиотики, отбеливатель и эмбриональная бычья сыворотка, для уничтожения бактерий12. Однако метод химической стерилизации привел к низкой выживаемости и скорости экклозии N. vitripennis13. Затем, в 2016 году, Shropshire et al. разработали NRMv2 с использованием метода стерилизации фильтра вместо метода химической стерилизации для устранения опасности антибиотиков и других веществ и оптимизировали процесс размножения13. К сожалению, этот метод все еще имеет некоторые недостатки, такие как проблемы, связанные с подготовкой и использованием среды, а также риски утопления, недокармливания или обезвоживания эмбрионов, личинок и закрытых куколок14. Wang and Brucker14 недавно улучшили протоколы выращивания Nasonia версии 3 (NRMv3) и безмикробного выращивания версии 2 (GFRv2). Эти улучшения снизили стоимость и потребление мультимедиа. Однако NRMv3 имеет очень короткое время хранения и очень подвержен загрязнению.
Основываясь на NRMv3, в этом исследовании были оптимизированы метод хранения инструмента для подготовки NRM и соотношение питательных веществ. Это методологическое уточнение облегчает использование N. vitripennis в качестве модели для исследований микробиома. По сравнению с NRMv3, разработанным Wang et al.14, улучшенный инструмент для выдавливания куколки Sarcophaga bullata, одного из сырьевых материалов NRM, значительно повышает эффективность производства тканевой жидкости куколки S. bullata по сравнению со шприцем объемом 60 мл с нижним отверстием, используемым Wang et al.14. Мы скорректировали соотношение питательных веществ NRM, что привело к определенному увеличению выживаемости безмикробных ос Nasonia, не влияя на время их развития. Кроме того, NRM упаковывали в центрифужные пробирки малой емкости (1,5 мл) и замораживали в холодильнике с температурой -20 °C, чтобы продлить срок хранения. Стоит отметить, что, хотя мы использовали комнатную муху Lucilia sericata в качестве хозяина и источника для получения NRM, этот протокол, вероятно, может быть адаптирован для других хозяев Nasonia, которые доступны в лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
С применением высокопроизводительных технологий обнаружения, таких как геномика и метаболомика, исследователи постепенно осознали, что в микробиоте кишечника существует огромное генетическое разнообразие и сложность метаболизма16. Эти симбиотические бактерии тесно свя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование: эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (32270538), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2022YFF0710603), Фондом естественных наук Пекина (6222046) и стратегическим финансированием CAS через схему финансирования CAS-CSIRO (152111KYSB20210011), присужденную G.H.W. Вклад авторов: все авторы разработали объем и направленность обзора и внесли свой вклад в написание рукописи.
Materials
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
