Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.
Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (ParkinT240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.
Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie1, aangeboren immuniteit2,3 en celsignalering 4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft8. PD is genetisch gekoppeld aan mitofagie, een mitochondriale kwaliteitscontroleroute die nodig is voor het handhaven van cellulaire homeostase die selectief beschadigde mitochondriën verwijdert 9,10. Studies hebben meerdere onafhankelijke mitofagieroutes geïdentificeerd, waaronder het FUN14-domein met 1 (FUNDC1) -gemedieerde mitofagie, Bcl-2 interagerende eiwit 3 (BNIP3) -gefaciliteerde mitofagie, NIX-afhankelijke mitofagie en de goed gekarakteriseerde PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) / Parkin-gereguleerde mitofagie10,11. PINK1 (een vermeend kinase) en Parkin (een E3 ubiquitine ligase) werken samen met fosfo-ubiquitinaat beschadigde mitochondriën, die de vorming van autofagosomen aandrijft die het beschadigde organel overspoelen en fuseren met lysosomen om de afbraak te initiëren 12,13,14,15,16. Mutaties in Parkin zijn in verband gebracht met PD-gebonden fenotypes zoals neurodegeneratie via het verlies van dopaminerge neuronen17,18.
Hier wordt een protocol beschreven waarin HeLa-cellen, routinematig gebruikte onsterfelijke cellen afgeleid van baarmoederhalskanker, worden gebruikt om de rol van Parkin bij het handhaven van mitochondriale netwerkgezondheid te onderzoeken. HeLa-cellen drukken verwaarloosbare niveaus van endogene Parkin uit en vereisen daarom exogene Parkin-expressie19. Om de rol van Parkin in de gezondheid van mitochondriale netwerken te bestuderen, worden HeLa-cellen getransfecteerd met wild-type Parkin (ParkinWT), een Parkin-mutant (ParkinT240R) of een lege controlevector. ParkinT240R is een autosomaal recessieve juveniele parkinsonismemutatie die de Parkin E3-ligaseactiviteit beïnvloedt, waardoor de efficiëntie van de mitofagieroute aanzienlijk wordt verminderd20. HeLa-cellen zijn onderhevig aan milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Behandeling met ernstige concentraties CCCP wordt routinematig gebruikt om parkine-gemedieerde mitofagie te induceren in verschillende cellijnen, zoals HeLa- en COS-7-cellen21,22,23.
Na de behandeling maakt het protocol gebruik van live beeldvorming van het mitochondriale netwerk met behulp van twee momenteel beschikbare mitochondriale gerichte fluorescerende kleurstoffen. Tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE) is een kationische kleurstof die fluoresceert op basis van mitochondriaal membraanpotentiaal24, terwijl MitoSOX een mitochondriale superoxide-indicator is waarbij de fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideconcentratie25. Ten slotte maakt het geschetste protocol gebruik van een op fluorescentie gebaseerde kwantificering en eenvoudige workflow om het mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren met minimale ruimte voor gebruikersbias. Hoewel dit protocol is ontworpen om de mitochondriale functie in HeLa-cellen te bestuderen, kan het worden aangepast voor extra cellijnen en primaire celtypen om de mitochondriale netwerkgezondheid kwantitatief te karakteriseren.
De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming30. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te …
The authors have nothing to disclose.
We danken de leden van het Evans-lab voor hun doordachte feedback op dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars en Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
기타 | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |