Denne protokol demonstrerer enkeltmolekyle overfladeforstærkede Raman-spredningsmålinger (SERS) ved hjælp af en DNA-origami nanoantenne (DONA) kombineret med colokaliseret atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-målinger.
Overfladeforstærket Raman-spredning (SERS) har evnen til at detektere enkeltmolekyler, for hvilke der kræves høj feltforbedring. Enkeltmolekyle (SM) SERS er i stand til at levere molekylespecifik spektroskopisk information om individuelle molekyler og giver derfor mere detaljerede kemiske oplysninger end andre SM-detektionsteknikker. Samtidig er der potentiale for at optrævle information fra SM-målinger, der forbliver skjult i Raman-målinger af bulkmateriale. Denne protokol skitserer SM SERS-målingerne ved hjælp af en DNA-origami nanoantenne (DONA) i kombination med atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-spektroskopi. En DNA-origami-gaffelstruktur og to guldnanopartikler kombineres for at danne DONA’erne med et mellemrum på 1,2-2,0 nm mellem dem. Dette muliggør en op til 1011 gange SERS-signalforbedring, der muliggør målinger af enkelte molekyler. Protokollen demonstrerer yderligere placeringen af et enkelt analytmolekyle i et SERS-hotspot, processen med AFM-billeddannelse og den efterfølgende overlejring af Raman-billeddannelse for at måle en analysand i en enkelt DONA.
DNA-origami er en nanoteknologisk teknik, der involverer foldning af DNA-strenge i specifikke former og mønstre. Evnen til at skabe strukturer med præcis kontrol på nanoskala er en af de vigtigste fordele ved DNA origami1. Evnen til at manipulere stof i så lille skala har potentialet til at revolutionere en lang række områder, herunder medicin, elektronik og materialevidenskab2. For eksempel er DNA-origamistrukturer blevet brugt til at levere lægemidler direkte til kræftceller3,4, skabe nanoskalasensorer til påvisning af sygdomme5,6 og skabe indviklede mønstre på overfladerne af materialer 6,7. Desuden har evnen til at bruge DNA-origami til at skabe komplekse nanoskalastrukturer skabt nye muligheder for at studere grundlæggende biologiske processer på nanoskala8.
Overfladeforstærket Ramanspredning (SERS) er en robust analytisk teknik, der detekterer og identificerer molekyler ved ekstremt lave koncentrationer9. Det er baseret på Raman-effekten, som er en ændring i bølgelængden af spredt lys10. SERS kræver et plasmonisk metalsubstrat for at forbedre Raman-signalet af molekyler, der adsorberes på det. Denne forbedring kan være op til 1011 gange større end signalet opnået fra det samme molekyle målt ved konventionel Raman-spektroskopi, hvilket gør SERS til en meget følsom metode til analyse af spormængder af stoffer11.
Raman-signalforbedringen af nanopartikler skyldes hovedsagelig elektromagnetisk forbedring baseret på excitation af lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR)12. I dette fænomen svinger elektroner i metalnanopartiklen kollektivt rundt om overfladen af metalnanopartiklen under lysforekomst. Dette resulterer i skabelsen af en stående bølge af elektroner kendt som et overfladeplasmon, som kan resonere med det indfaldende lys. LSPR forbedrer i høj grad det elektriske felt nær partiklens overflade, og den optiske absorption af partiklen er maksimal ved plasmonresonansfrekvensen. Overfladeplasmonens energi afhænger af formen og størrelsen af metalnanopartiklen samt egenskaberne af det omgivende medium13. En højere forbedring kan opnås yderligere ved plasmoniske koblinger, såsom når to nanopartikler er tæt på hinanden i en afstand på ca. 2,5 gange diameterlængden eller mindre14. Nærheden får LSPR af begge nanopartikler til at interagere med hinanden, hvilket forbedrer det elektriske felt i mellemrummet mellem partiklerne med flere størrelsesordener, hvilket langt overstiger forbedringen af en enkelt nanopartikel15,16,17. Størrelsen af forbedringen er omvendt proportional med afstanden mellem nanopartiklerne; Når afstanden mindskes, vises et kritisk punkt, hvor forbedringen er tilstrækkelig til at detektere enkeltmolekyler (SM’er)18.
DNA-origami repræsenterer en nøgleteknologi, der effektivt kan arrangere plasmoniske nanopartikler for at udnytte og optimere den plasmoniske kobling19. Samtidig kan molekyler af interesse placeres præcist på det sted, hvor optisk detektion er mest effektiv. Dette er blevet demonstreret med DNA-origami-baserede plasmoniske nanoantenner til fluorescensdetektion20. I modsætning til påvisning af fluorescerende etiketter giver SERS mulighed for at detektere et direkte kemisk fingeraftryk af et molekyle, hvilket gør enkeltmolekylet SERS meget attraktivt til sensing samt overvågning af kemiske reaktioner og mekanistiske undersøgelser. DNA-origami kan også bruges som en maske til at fremstille plasmoniske nanostrukturer med veldefinerede former21, selvom muligheden for at placere målmolekyler præcist i hot spot derefter går tabt.
Ved hjælp af colokaliseret atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-målinger kan vi opnå Raman-spektrene fra en enkelt DNA-origami nanoantenne (DONA) og potentielt et enkelt molekyle, hvis det placeres i positionen med højeste signalforbedring. DONA består af en DNA-origami-gaffel og to præcist placerede nanopartikler, fuldt belagt med DNA, der supplerer udvidede hæfteklammer bundet til DNA-origamien. Ved DNA-hybridisering er nanopartiklerne bundet til DNA-origami-gaflen med et mellemrum på 1,2-2,0 nm mellem nanopartikeloverfladerne22. En sådan samling skaber et hot spot mellem nanopartiklerne med en signalforbedring på op til 1011 gange, som beregnet ud fra FDTD-simuleringer (finite difference time domain)22, hvilket muliggør SM SERS-målinger. Imidlertid er volumenet af den højeste forbedring lille (i området 1-10 nm3 ), og derfor skal målmolekylerne placeres præcist i dette hot spot. DNA-origami-gaflen tillader positionering af et enkelt molekyle mellem de to nanopartikler ved hjælp af en DNA-gaffelbro og passende koblingskemi. Ikke desto mindre er det meget udfordrende at observere sådanne SM’er i Raman-spektre22. Alternativt kan nanopartiklerne belægges fuldt ud med målmolekylet, såsom et TAMRA-farvestof, for at muliggøre enkelte DONA-målinger med en højere SERS-intensitet21. I dette tilfælde er TAMRA kovalent bundet til DNA-belægningsstrengen (figur 1).
SM SERS er et kraftfuldt værktøj, der giver forskere mulighed for at studere adfærd og interaktioner mellem individuelle molekyler i en prøve1. En sådan teknik tillader analyse af systemer på et hidtil uset følsomhedsniveau, hvilket giver ny indsigt i enkeltmolekylernes grundlæggende opførsel og fordelingen af kemiske eller fysiske egenskaber over et ensemble af molekyler og hjælper med at identificere relevante mellemprodukter i kemiske processer. Men at placere et enkelt molekyle i hot spot, samtidig med at man sørger for, at hot spot har tilstrækkelig overfladeforbedring, kan være ret udfordrende27. De beskrevne DONA’er i denne protokol kan præcist placere et enkelt molekyle i hot spot mellem to guldnanopartikler, samtidig med at der opnås en 1011 gange overfladeforbedring.
Afstanden mellem nanopartiklerne er afgørende for, at DONA-enheden når den krævede overfladeforbedring til SM SERS-undersøgelser. DONA’erne er optimeret til sfæriske nanopartikler med størrelser mellem 60 og 80 nm. Desuden kan nanopartiklernes kvalitet påvirke hybridiseringen af nanopartiklerne betydeligt med DNA-origamigaflerne; Når nanopartiklerne, der anvendes i belægningstrinnet, er ældre end 6 måneder, begynder effektiviteten af hybridisering at falde.
Et andet kritisk aspekt af protokollen er, at de trin, der kræver et nøjagtigt forhold mellem komponenter, skal følges nøjagtigt, ellers dannes DONA’erne ikke korrekt. DNA-origamigaflen er ekstremt følsom over for temperaturramping-protokollen, med ændringer, der påvirker strukturens integritet eller forhindrer gafler i at dannes.
Amorf kulstofgenerering er et væsentligt problem under SERS-målinger, fordi dens toppe typisk er i samme område som fingeraftryksområdet for mange molekyler (1.200-1.700 cm-1). Selvom dannelsen endnu ikke er fuldt forstået, er den normalt forbundet med høj lasereffekt eller lange integrationstider28. For en sikkerheds skyld bør der anvendes den laveste lasereffekt og den kortest mulige integrationstid. Dette opnås imidlertid ikke let, fordi der skal opnås en balance mellem at opnå det ønskede SERS-signal og undgå dannelse af amorft kulstof.
DONA’erne er meget alsidige som et SM-system med hensyn til de forskellige typer og former af nanopartikler, der kan bruges, såsom sølvkugler, guldblomster eller stjerner. Derudover kan molekylet under undersøgelse let erstattes ved kun at ændre DNA-strengen midt i broen uden ændringer i proceduren. Skift til proteiner som cytokrom C kunne gøres ved at have en pyridinmodificeret DNA-indfangningsstreng i broen, som ville binde cytokrom C og sikre, at den er i hot spot for SM SERS-målinger22. Dette betyder også, at du fleksibelt vælger laseren til bestråling, potentielt ved hjælp af en laser, der giver maksimal forbedring.
Sammenfattende er denne metode pålidelig til samling af DONA-strukturer og anvendelse af dem til enkeltmolekyle overfladeforstærkede Raman-spektroskopimålinger.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC; consolidator Grant No. 772752).
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL | Merck | UFC5100BK | |
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) | SIGMA Aldrich | T9650 | |
60 nm goldspheres, bare (citrate) | NanoComposix | AUCN60 | |
ACCESS-NC-A AFM probes | SCHAEFER-TEC | ||
Agarose powder | SIGMA Aldrich | 9012-36-6 | |
AuNP DNA coating strands | IDT | ||
AuNP DNA coating strands (TAMRA) | SIGMA Aldrich | ||
Glycerol | SIGMA Aldrich | 56-81-5 | |
Heraeus Fresco 17 centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution | HORIBA | ||
Magnesium chloride | SIGMA Aldrich | 7786-30-3 | |
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) | Metabion | ||
Nanofork DNA staple strands | SIGMA Aldrich | ||
ParafilmM | Carl Roth | CNP8.1 | |
Primus 25 Thermocycler | Peqlab/VWR | ||
Silicon wafer | Siegert wafer | BW14076 | |
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) | Tilibit nanosystems | ||
TCEP solution | SIGMA Aldrich | 51805-45-9 |