Parthenogenetic 곤충, 겨자 진딧물, Lipaphis erysimi (Kalt.)에 대한 곤충 병원성 곰팡이의 무균 효과 평가
Summary
이 프로토콜은 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물(Lipaphis erysimi (Kalt .))에 대한 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 효과를 평가하기 위해 최적화된 분리형 잎 생물검정 시스템을 제공합니다. 이 방법은 페트리 접시 실험 중 데이터 수집 프로세스를 간략하게 설명하여 연구원이 겨자 진딧물 및 기타 단일유전 곤충에 대한 EPF의 독성을 일관되게 측정할 수 있도록 합니다.
Abstract
겨자 진딧물(L. erysimi)은 다양한 십자화과 작물을 감염시키고 식물 바이러스를 전염시키는 해충입니다. 친환경적인 해충 관리를 달성하기 위해 곤충병원성 곰팡이(EPF)는 이 해충을 방제하기 위한 잠재적인 미생물 방제제입니다. 따라서 현장 적용 전에 페트리 접시 조건에서 분리한 EPF의 독성 스크리닝이 필요합니다. 그러나 겨자 진딧물은 단일유전학적 곤충이기 때문에 페트리 접시 실험 중에 데이터를 기록하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 마이크로 분무기를 사용하여 진딧물에 분생포자를 접종하고 포자 현탁 후 공기 건조를 촉진하여 익사를 방지하는 분리 잎 생물 검정을 위한 수정된 시스템이 개발되었습니다. 시스템은 관찰 기간 내내 높은 상대 습도를 유지했으며 잎 디스크는 10일 이상 신선하게 유지되어 진딧물의 단일유전학적 번식을 허용했습니다. 자손이 쌓이는 것을 방지하기 위해 페인팅 브러시를 사용하여 매일 제거하는 과정이 구현되었습니다. 이 프로토콜은 겨자 진딧물 또는 기타 진딧물에 대한 EPF 분리물의 독성을 평가하기 위한 안정적인 시스템을 보여주며, 진딧물 방제를 위한 잠재적 분리물을 선택할 수 있습니다.
Introduction
겨자 진딧물(L. erysimi)은 다양한 십자화과 작물을 감염시켜 상당한 경제적 손실을 초래하는 악명 높은 해충입니다1. 진딧물 침입을 막기 위해 몇 가지 체계적인 살충제가 권장되었지만, 이러한 살충제의 빈번한 사용은 살충제 내성에 대한 우려를 불러일으킨다 2,3. 따라서 친환경 해충 관리 측면에서 곤충병원성 곰팡이(EPF)는 적절한 대체 방제 전략이 될 수 있습니다. EPF는 숙주의 표피를 뚫고 들어가 숙주를 감염시킬 수 있는 곤충 병원체로, 진딧물 및 기타 식물을 빨아들이는 곤충을 방제하는 강력한 약제입니다4. 또한, EPF는 식물 병원균 길항 작용 및 식물 성장 촉진과 같은 이점을 제공하는 실현 가능하고 지속 가능한 해충 관리 기술임이 입증되었습니다5.
EPF는 곤충 토양 미끼를 통해 얻거나 현장의 곤충 시체에서 분리 할 수 있습니다 6,7. 그러나 진균 분리물을 추가로 사용하기 전에 병원성 스크리닝이 필요합니다. 심각한 피해를 줄 수 있는 중요한 작물 해충인 진딧물에 대한 EPF의 효과에 대한 여러 연구가 수행되었습니다 8,9. 다양한 종의 진딧물 중에서 겨자 진딧물은 Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., 심지어 Alternaria의 여러 균주에 대한 감수성을 테스트했습니다.이 균주는 주로 부생균 및 식물 병원성 곰팡이로 알려져 있지만 겨자 진딧물에 대해 치명적인 효과를 보였습니다10,11,12.
실험실 조건에서 진딧물에 대한 EPF의 효과를 평가하기 위해 생물학적 검정은 접종 챔버와 곰팡이 접종의 두 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다. 현재 프로토콜은 진딧물이 촉촉한 면으로 감싼 잎자루가 있는 절제된 잎, 댐핑된 여과지가 늘어선 페트리 접시가 있는 절제된 잎 디스크, 화분 식물에 대한 직접 유지 관리, 또는 페트리 접시 또는 용기(10) 내의 물 한천에 내장된 절제된 잎 디스크와 같은 다양한 방법을 사용하여 진딧물을 유지할 수 있는 접종 챔버의 구성을 설명합니다. 11,13. 진균 접종을 위한 일반적인 방법으로는 분생포자 살포, 분생포자 현탁액에 진딧물 침지, 분생포자 현탁액에 잎 담그기, 식물 내생식물 접종11,14,15,16이 있다. 다양한 접종 방법이 존재하지만 생물학적 검정은 현장 적용 조건을 시뮬레이션해야 합니다. 예를 들어, 잎 담근 방법(12,17)의 경우, EPF의 효율을 평가할 수 있지만, 진딧물이 곰팡이가 집재된 잎에 감염되기 때문에, 우선 침투 부위인 진딧물의 등쪽은 일반적으로 곰팡이에 노출되지 않는다.
실험실 조건에서 EPF의 살충 효과를 평가하기 위해 이 프로토콜은 Yokomi 및 Gottwald18에 의해 설명된 분리 잎 방법을 약간의 수정과 함께 사용한 다음 마이크로 분무기를 사용하여 분생포자 접종을 제안합니다. 이 방법은 물의 추가 보충을 요구하지 않고 최소 7일 동안 생물학적 검정 챔버에서 약 100%의 습도를 유지합니다18,19. 또한, 진딧물을 한 표면에 가두면 분생포자 살포에 노출되고 관찰이 용이해진다20. 그러나 진딧물은 접종 챔버 내에서 이동하는 동안 노출된 한천 표면에 달라붙을 수 있습니다. 또한, 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물에 대한 페트리 접시 실험에서 데이터를 기록하는 것은 빠른 발달과 번식으로 인해 어려울 수 있습니다. 백신을 접종한 성인과 제거하지 않고는 자손을 구별하기 어렵습니다. 이 단계를 진행하는 방법에 대한 세부 정보는 거의 언급되지 않으며 잎 소비 면적과 같은 일부 일관되지 않은 요소를 최적화해야 합니다.
이 프로토콜은 겨자 진딧물에 대한 EPF 분리물의 독성을 스크리닝하기 위한 안정적인 시스템을 보여주며, 광범위한 EPF 라이브러리에서 다양한 진딧물 종에 대한 잠재적 분리물을 선택할 수 있습니다. 현장에서 채취한 진딧물을 식별할 수 있으며, 일관된 결과를 얻을 수 있는 쉽고 실현 가능한 방법론을 사용하여 다양한 곰팡이 분리물의 살균 효과를 평가하기 위해 겨자 진딧물의 충분한 실험실 집단을 설정할 수 있습니다. 진딧물은 농업생태계의 강렬하고 반복적인 인위적 압력에 대응하여 여러 진화 메커니즘을 개발하여 식량 안보에 도전장을 내밀었다9. 그러므로, 이 기술된 방법은 다양한 진딧물 종에 대한 잠재적인 EPF 분리물을 평가하기 위해 확장될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
채소의 일종인 십자화과는 겨자 진딧물(L. erysimi)과 양배추 진딧물(Brevicoryne brassicae)을 포함한 여러 진딧물 종에 의해 자주 감염됩니다.26 두 종 모두 대만27에서 보고되었으며, 채취 장소에서 공존할 가능성이 있다. 밀접하게 관련된 진딧물 종을 구별하기 위해 본 연구는 다중 프라이머 세트21을 이용한 분자 식별 기법을 사용하였?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 과학기술부(MOST)의 109-2313-B-005 -048 -MY3의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
