액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
액틴 및 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력("악토미오신 수축성")은 세포 분열, 세포 이동, 상피 접힘 및 분지 형태 형성과 같은 여러 길이 척도에서 세포 및 조직의 형태학적 변화에 중요합니다. 형태 형성에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 기존의 유전적 또는 약리학적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 악토미오신 수축의 신속한 비활성화를 허용하는 접근 방식을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜은 정확한 시간 및 공간 제어로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 억제하기 위해 CRY2-CIBN 기반 광유전학적 이합체화 시스템인 Opto-Rho1DN의 사용을 보여줍니다. 이 시스템에서 CRY2는 Rho1(Rho1DN)의 우세한 음성 형태에 융합되는 반면 CIBN은 원형질막에 고정됩니다. CRY2 및 CIBN의 청색광 매개 이량체화는 세포질에서 원형질막으로 Rho1DN의 빠른 전좌를 초래하며, 여기서 내인성 Rho1을 억제하여 악토미오신 비활성화를 초래합니다. 또한, 이 기사는 초파리 복부 고랑 형성 동안 상피 긴장을 생성하는 악토미오신의 역할을 조사하기 위해 악토미오신의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 레이저 절제를 결합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최소한의 수정으로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 포함하는 다른 많은 형태학적 과정에 적용할 수 있습니다. 전반적으로, 이 광유전학적 도구는 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학을 제어하는 악토미오신 수축성의 기능을 해부하는 강력한 접근 방식입니다.
서론
액토미오신 수축성(actomyosin contractility)은 F-액틴 네트워크에서 비근육 미오신 II(이하 '미오신')에 의해 가해지는 수축력으로, 세포 형태를 변화시키고 조직 수준의 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나이다 1,2. 예를 들어, 상피 세포의 정점 도메인에서 악토미오신 수축성의 활성화는 정단 수축을 초래하며, 이는 상피 접힘, 세포 압출, 박리 및 상처 치유를 포함한 다양한 형태 형성 과정을 촉진합니다 3,4,5,6,7 . 미오신의 활성화는 그의 조절 경쇄의 인산화를 필요로 한다. 이 변형은 미오신 분자의 억제 형태를 완화하여 양쪽 끝에 여러 헤드 도메인이 있는 양극성 미오신 필라멘트 다발을 형성할 수 있도록 합니다. 양극성 미오신 필라멘트는 액틴 필라멘트의 역평행 운동을 유도하고 수축력 1,8,9
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 유전자 십자가 설정 및 난자 채취 컵 준비
- 광유전학적 계통 UASp-CIBNpm(I)에서 암컷 파리(처녀)를 선택합니다. UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)를 입체현미경 하의CO2 패드 상에서 모체 GAL4 드라이버 라인 67 Sqh-mCherry로부터 수컷 파리와 교배시키고; 15 E-카데린-GFP.
참고: 67과 15는 각각 두 번째(II) 및 세 번째(III) 염색체에 삽입된 모체-Tubulin-GAL4를 나타냅니다(52). 이 프로토콜에 사용된 GAL4 라인은 또한 mCherry 태그된 미오신 조절 경쇄 Sqh(스파게티 스쿼시)37 및 GFP 태그가 붙은 E-cadherin53을 발현합니다. 광유전학적 계통의 파리는 여전히 FM7 및 TM6 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다. 모체 GAL4 드라이버 라인의 파리는 여전히 CyO 및 TM3 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다. - ~10일 후, 다음 유전자형을 갖는 F1 암컷 파리를 선택합니다: UASp-CIBNpm/+; 67제곱미터체리/+; 15 E-카데린-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mC....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
정점 수축을 겪고 있는 자극되지 않은 배아에서 Sqh-mCherry는 복부 중배엽 세포의 정근단 영역에서 농축된 반면 CRY2-Rho1DN-mCherry는 세포질이었습니다(그림 1A). 수축 영역 내의 레이저 절제는 AP 축을 따라 빠른 조직 반동을 일으켰습니다(그림 1B, C). 자극된 배아에서 CRY2-Rho1DN-mCherry 신호는 원형질막에 국한된 반면, Sqh-mCherry의 정점 신호는 완전히 사라졌습니다(그림 1A). 자극된 배아에서 레이저 절제는 그림 1B, C 에 예시되고 그림 1D에서 정량화된 바와 같이 명백한 조직 반동을 초래하지 않았습니다. 이러한 결과는 조직 긴장의 생성이 활성 치.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 악토미오신 수축성이 비활성화된 직후 조직 장력의 변화를 조사하기 위해 광유전학과 레이저 절제의 병용을 설명했습니다. 여기에 설명된 광유전학적 도구는 Rho1(Rho1DN)의 지배적인 음성 형태를 이용하여 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 급격히 억제합니다. 초파리 복부 고랑 형성의 맥락에서 Opto-Rho1DN의 이전 특성화는 이 도구가 동시 미오신 불활성화 및 액틴 분해를 통해 정점 악토미오신 수축성의 빠른 불활성화를 매개하는 데 매우 효과적임을 입증했습니다41. 특히, 정점 수축 시에 배아의 자극은 정점 수축을 겪는 세포에서 60초 이내에 정점 미오신 신호의 감소를 초래하였다41. Rho1 억제에 따른 피질 미오신의 이러한 빠른 제거는 각각 Rho1 및 미오신 경쇄 포스파타제에 대한 GTPase 활성화 단백질(GAP)의 활성에 의해 유발되는 활성 및 비활성 상태를 통한 Rho1 및 미오신의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 이미징 지원에 대해 Ann Lavanway에게 감사를 표합니다. 저자들은 시약을 공유해 준 Wieschaus 연구실과 De Renzis 연구실에, 플라이 스톡에 대해 Bloomington Drosophila Stock Center에 감사를 표합니다. 이 연구는 NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 및 미국 암 학회 기관 연구 보조금 #IRG-82-003-33에 의해 BH에 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-1.5-10-C | 샘플 준비에 사용 |
| 60mm × 15mm 페트리 접시와 뚜껑 | Falcon | 351007 | 샘플 준비에 사용 |
| 현미경을 덮기 위한 검은색 천 | 온라인 | NA | 원치 않는 빛 자극을 피하기 위해 사용 |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | 배아 탈부착 |
| CO2 패드 | Genesee Scientific | 59-114 | 교차 설정에 사용 |
| ddH2O | NANA | 샘플 준비에 사용 | |
| Dumont Style 5 핀셋 | VWR | 102091-654 | 샘플 준비에 사용 |
| 속눈썹 도구(순수한 빨간색 세이블 원형 브러시 #2로 제작) | VWR | 22940-834 | 시료 준비에 사용됨 |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | 이미지 획득 및 광유전학 자극에 사용됨 |
| 할로카본 오일 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | 배아 단계 시각화에 사용됨 |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA 이미지 분석에 사용됨 | |
| MATLAB | MathWorks | NA | 이미지 분석 |
| 에 사용됨Nikon SMZ-745 입체경 | Nikon | NA | |
| 동시 이중 파장 다광자 이미징을 위한 InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers가 있는 Olympus FVMPE-RS 다광자 현미경, 25x/NA1.05 수침 대물렌즈(XLPLN25XWMP2) 및 광 활성화/자극을 위한 IR/VIS 자극 장치에 사용됩니다. 이 시스템에는 TRITC 필터(39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) 및 백색광을 방출하는 형광 조명 장치. | Olympus | NA | 이미지 획득 및 광유전학적 자극에 사용 |
| SP Bel-Art 100개 장소 폴리프로필렌 냉동 보관 상자(검은, 샘플 전달용 차광 상자) | VWR | 30621-392 | 원치 않는 광 자극을 피하기 위해 사용 |
| FM1403 Fluores용 UV 필터 실드(주황색-빨간색 플라스틱 실드) | 볼리옵틱 | 스 FM14036151 | 원치 않는 광 자극 |
| 을 피하기 위해 사용VITCHELO V800 헤드램프, 흰색 및 빨간색 LED 조명 포함 | Amazon | NA | 원치 않는 빛 자극을 피하는 데 사용됩니다. |
참고문헌
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
