Her beskrives en etablert metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiummålinger i humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter ved bruk av en optikkbasert plattform. Denne plattformen gjør det mulig for forskere å studere effekten av mutasjoner og responsen på ulike stimuli på en rask og reproduserbar måte.
Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å studere mutasjonsmedierte endringer i kardiomyocyttfunksjonen og definere effekten av stressorer og legemiddelintervensjoner. I denne studien er det demonstrert at dette optikkbaserte systemet er et kraftig verktøy for å vurdere funksjonelle parametere for hiPSC-CM i 2D. Ved å bruke denne plattformen er det mulig å utføre parede målinger i et godt bevart temperaturmiljø på forskjellige plateoppsett. Videre gir dette systemet forskere øyeblikkelig dataanalyse.
Denne artikkelen beskriver en metode for å måle kontraktiliteten til umodifiserte hiPSC-CMer. Kontraksjonskinetikk måles ved 37 °C basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt ved relaksasjon ved en samplingsfrekvens på 250 Hz. I tillegg kan samtidige målinger av intracellulære kalsiumtransienter oppnås ved å laste cellen med en kalsiumfølsom fluorofor, slik som Fura-2. Ved hjelp av en hyperbryter kan ratiometriske kalsiummålinger utføres på et 50 μm diameter belysningspunkt, tilsvarende området for kontraktilitetsmålingene.
Hjertesvikt er den ledende dødsårsaken over hele verden. I 2019 forårsaket hjerte- og karsykdommer 18,6 millioner dødsfall globalt, noe som gjenspeiler en økning på 17,1% det siste tiåret1. Til tross for forskernes innsats for å identifisere legemiddelmål for å forebygge og kurere hjertesvikt, er pasientresultatene fortsatt dårlige2. Forskjellen i patofysiologien til dyremodeller med hensyn til mennesker kan være en av de underliggende faktorene i den begrensede suksessen for optimalisering av hjertesviktbehandling3. Ytterligere menneskelignende modeller er berettiget til å modellere sykdom og teste toksisiteten og effektiviteten av nye legemiddelforbindelser.
Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å definere cellulære patomekanismer indusert av stressorer, iskemi, endret metabolisme eller patogene genvarianter, og effektiviteten og toksisiteten av legemiddelintervensjoner4. For å definere effekter på de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, er et høyhastighetssystem som måler de systoliske og diastoliske egenskapene til cellulære sammentrekninger på en objektiv og reproduserbar måte, berettiget. Dette overordnede målet med den nåværende studien er å demonstrere at et optikkbasert system er et kraftig verktøy for å utføre sanntidsanalyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CMs.
For tiden er det flere plattformer for å evaluere kontraktiliteten til hiPSC-CMs. Imidlertid tilbyr nåværende systemer enten en langsom avlesning, eller det nødvendige antall celler kan være en utfordring. Etikettfrie videomålingssystemer5,6 er avhengige av post-hoc-analyse av videoer, noe som krever mye lagringsplass og mangler direkte tilbakemelding under videoopptak. I tillegg er tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning vanskelig å oppnå, og kan føre til undersampling. Andre metoder for å bestemme kardiomyocytegenskaper, for eksempel grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-redigerte hiPSC-CMs7 med fluorescerende reportere, kan forstyrre genstabiliteten til cellene og kreve spesialisert laboratoriekompetanse.
For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, ble et unikt optikkbasert målesystem utviklet og introdusert i denne studien. Denne plattformen muliggjør kontraktilitetsmålinger på umodifiserte hiPSC-CM-er ved ganske enkelt å replatere dem på et hvilket som helst nødvendig plateformat, uten noen begrensning i platestørrelse. Videre tillater sanntidsmålinger direkte observasjon og analyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CM, og gir dermed en eksperimentell innstilling for å umiddelbart justere og optimalisere protokoller. Videre lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parrede målinger på samme prøve, og dermed øker kraften i forsøkene.
For å demonstrere det optikkbaserte systemet ble kontraktilitetsmålinger utført på en kontrollhiPSC-CM-linje. Denne kontrollhisc-linjen ble generert fra dermal fibroblast av en sunn mannlig donor med en normal karyotype8. Kontraksjonskinetikk ble målt ved 37 °C, basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt under relaksasjon med 250 Hz samplingsfrekvens. Siden den nøyaktige starten på sammentrekningen ikke alltid kan bestemmes entydig, ble tidspunktet da 20% av topphøyden ble nådd (tid til topp 20%) tatt som utgangspunkt for målinger av tid til topp. Ved å gjøre dette ble det funnet mindre variabilitet for denne parameteren i en prøve. På samme måte, ettersom det nøyaktige tidspunktet signalet returnerer til baseline er vanskelig å vurdere, ble tiden det tok å nå 80 % av returen til baseline fra topp (tid til baseline 80 %) brukt til å beskrive relaksasjonstiden.
Samlede kontraktilitetsmålinger inkluderte hvilende slagfrekvenser, tiden fra 20% peak til peak contraction (TP. Con), og tiden fra maksimal sammentrekning til 80 % av baseline (TB. Con80) (figur 1B). For å teste effekten av en stressor ble cellene inkubert med isoprenaline (ISO). I tillegg, sammenfallende med kontraktilitetsmålinger, ble Ca 2+ transienter målt ved å laste cellene med Fura-2-acetoksymetylester (Fura-2 AM) med en samplingsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriske Ca2+ målinger9 ved hjelp av en hyperbryter ble gjort på et 50 μm diameter belysningsområde, tilsvarende arealet av kontraktilitetsmålingene. Ca 2+ måledata er vist som tid fra 20 % topp til topp i Ca2+ forbigående (TP.Ca) og tid fra topp til 80 % av basislinjen (TB.Ca80) (figur 1C). Et raskt, automatisk dataanalyseverktøy ble brukt for å gi gjennomsnittlige kontraktile og kalsiumkinetiske parametere for hvert område.
I denne studien beskrives en metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiumtransientmålinger på hiPSC-CM og studere effekten av stressorer/medikamenter på disse cellene. Kontraktilitetsmålinger, ratiometriske kalsiummålinger og respons på ISO ble utført på tre forskjellige runder med differensiering som biologiske replikater. For hver biologisk replikat ble det utført målinger på tre brønner som de tekniske replikatene. Bakgrunnen for å utføre målingene på denne måten var å sikre at den biologiske variabiliteten og den tekniske variasjonen i prøven og plattformen kunne evalueres. Bortsett fra å vurdere riktig antall biologiske og tekniske replikater, kan hiPSC-CM-dyrkingstilstanden spille en viktig rolle for å oppnå konstante og robuste resultater. Det er viktig å være konsistent med kriterier, for eksempel alder av hiPSC-CMs, sammensetning av medium, replating forhold, og sammensatt inkubasjonstid under målinger. I denne studien tok det i gjennomsnitt 568 ± 24 s å måle 11 områder to ganger i 10 s i en brønn. Dette inkluderer en ISO-inkubasjonstid på 79 ± 11 s. Dette kommer ned til omtrent 10 min per brønn, noe som skal gjøre det mulig for forskere å måle en full 24-brønnsplate i ~ 4 timer. Klimakontrollen brukes til å opprettholde stabil CO2. Dette gjør det mulig å måle effekten av forbindelser/stressfaktorer på hiPSC-CM på en høyhastighets måte.
For å måle kontraktilfunksjonen til iPSC-CMs, er det flere eksisterende systemer som er avhengige av optogenetikk13 eller etikettfri videobasert mikroskopi 5,6. Optogenetikksystemer er ganske komplekse og krever spesielle teknikker for å oppnå enten elektrofysiske og / eller kontraktilitetsdata. Andre systemer er avhengige av post-hoc-analyse av videoer, noe som krever mye lagring og mangler direkte tilbakemelding under videooppkjøp. I tillegg er det vanskelig å oppnå tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning, noe som kan føre til undersampling. På samme måte kan CRISPR/CAS-9-redigerte hiPSC-CM med fluorescerende reportere7 introdusere uønskede effekter på kardiomyocyttatferd. Bruk av fluorescerende fargestoffer for sammentrekningsavslapningsmålinger er også en elegant tilnærming, men begrenser utførelsen av eksperimenter på samme prøve over en lengre periode14.
Denne optikkbaserte måleplattformen kan imidlertid brukes til å måle sammentrekningsavslapningstider uten å bruke fluorescerende fargestoff eller invasive metoder. Siden pikselkorrelasjon ikke gir romlig informasjon, kan denne metoden imidlertid ikke brukes til å måle styrken på sammentrekningen, men kan bare pålitelig oppdage endringer i hastigheten på sammentrekning og avslapning. Det introduserte målesystemet er temperaturkontrollert og kan samle kalsium- og kontraktilitetsdata i sanntid med en oppløsning på >200 bilder per sekund. I tillegg lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parvise målinger, og dermed øker kraften til eksperimentene. Videre gir denne plattformen forskere muligheten til å lagre data og analysere dem umiddelbart etter eksperimentet. Samlet sett viser dette optikkbaserte målesystemet seg å være en lovende metode for å studere cellulære patomekanismer, kan evaluere effekten av forbindelser på funksjonaliteten til hiPSC-CM, og kan være nyttig med den prekliniske prosessen i legemiddelscreening.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har delvis blitt finansiert av Eurostars-stipendet Estars2 113937 CARDIOMYO (EM &; DK) og NWO-VICI grant 91818602 (JV).
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |