בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.
Abstract
הלב המתפתח הוא מבנה מורכב המכיל תאי אב שונים הנשלטים על ידי מנגנוני בקרה מורכבים. בחינת ביטוי הגנים ומצב הכרומטין של תאים בודדים מאפשרת זיהוי סוג התא ומצבו. גישות ריצוף חד-תאי חשפו מספר מאפיינים חשובים של הטרוגניות תאי אב לבביים. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות בדרך כלל לרקמה טרייה, מה שמגביל מחקרים עם תנאי ניסוי מגוונים, מכיוון שיש לעבד את הרקמה הטרייה בבת אחת באותה ריצה כדי להפחית את השונות הטכנית. לכן, יש צורך בהליכים קלים וגמישים להפקת נתונים משיטות כגון ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNA-seq) ובדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (snATAC-seq) בתחום זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד מהיר של גרעינים עבור אומיקה דואלית של גרעינים בודדים (snRNA-seq משולב ו-snATAC-seq). שיטה זו מאפשרת בידוד גרעינים מדגימות קפואות של תאי אב לבביים וניתן לשלב אותה עם פלטפורמות המשתמשות בתאים מיקרופלואידים.
Introduction
בקרב מומים מולדים, מומי לב מולדים (CHDs) הם הנפוצים ביותר, המתרחשים בכ -1% מלידות החי בכל שנה 1,2. מוטציות גנטיות מזוהות רק במיעוט מהמקרים, מה שמרמז על כך שגורמים אחרים, כגון חריגות בבקרת גנים, מעורבים באטיולוגיה של CHD 2,3. התפתחות הלב היא תהליך מורכב של סוגי תאים מגוונים ומקיימים אינטראקציה, מה שהופך את זיהוי מוטציות סיבתיות לא מקודדות והשפעותיהן על בקרת גנים למאתגר. אורגנוגנזה של הלב מתחילה באבות תאיים שיוצרים תת-סוגים שונים של תאי לב, כולל תאי מיוקרדיאל, פיברובלסט, אפיקרדיאלי ואנדוקרדיאלי 4,5. גנומיקה של תא בודד מתגלה כשיטת מפתח לחקר התפתחות הלב ולהערכת ההשפעה של הטרוגניות תאית על בריאות ומחלות6. פיתוח שיטות מולטי-אומיות למדידה סימולטנית של פרמטרים שונים והרחבת צינורות חישוביים הקל על גילוי סוגי תאים ותת-סוגים בלב תקין וחולה6. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידוד אמין של גרעין יחיד עבור תאי אב לבביים קפואים המתקבלים מעוברי עכברים, התואם ל- snRNA-seq ו- snATAC-seq במורד הזרם (כמו גם snRNA-seq ו- snATAC-seq בשילוב)7,8,9.
ATAC-seq היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורי כרומטין פתוחים רגולטוריים ומיקום של נוקלאוזומים10,11. מידע זה משמש להסקת מסקנות לגבי המיקום, הזהות והפעילות של גורמי שעתוק. ניתן לנתח את הפעילות של גורמי הכרומטין, כולל משפצים, כמו גם את פעילות השעתוק של RNA פולימראז, מכיוון שהשיטה רגישה מאוד למדידת שינויים כמותיים במבנה הכרומטין 1,2. לפיכך, ATAC-seq מספק גישה חזקה ונטולת פניות לחשיפת המנגנונים השולטים בוויסות שעתוק בסוג תא מסוים. פרוטוקולי ATAC-seq אומתו גם למדידת נגישות הכרומטין בתאים בודדים, וחשפו שונות בארכיטקטורת הכרומטין בתוך אוכלוסיות תאים10,12,13.
למרות שבשנים האחרונות חלה התקדמות ניכרת בתחום התאים הבודדים, הקושי העיקרי הוא עיבוד הדגימות הטריות הדרושות לביצוע ניסויים אלה14. כדי לעקוף קושי זה, בדיקות שונות בוצעו במטרה לבצע ניתוחים כגון snRNA-seq ו snATAC-seq עם רקמת לב קפואה או תאים15,16.
מספר פלטפורמות שימשו לניתוח נתוני גנומיקה של תא בודד17. הפלטפורמות הנפוצות לביטוי גנים של תא בודד ופרופיל ATAC הן פלטפורמות לאנקפסולציה של טיפות מיקרופלואידיות מרובות17. מכיוון שפלטפורמות אלה משתמשות בתאים מיקרופלואידים, פסולת או אגרגטים יכולים לסתום את המערכת, וכתוצאה מכך נתונים שאינם שמישים. לפיכך, הצלחתם של מחקרים חד-תאיים תלויה בבידוד מדויק של תאים/גרעינים בודדים.
הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בגישה דומה למחקרים אחרונים המשתמשים ב- snRNA-seq ו- snATAC-seq כדי להבין מומי לב מולדים 18,19,20,21,22,23. הליך זה משתמש בדיסוציאציה אנזימטית של רקמת לב טרייה שנותחה במיקרודיסקציה ואחריה שימור בהקפאה של תאי אב לבביים של עכברים. לאחר ההפשרה, התאים בני קיימא מטוהרים ומעובדים לבידוד גרעיני. בעבודה זו, פרוטוקול זה שימש בהצלחה להשגת נתוני snRNA-seq ו- snATAC-seq מאותה הכנה גרעינית של תאי אב לבביים של עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח ההרכב התאי של הלב המתפתח על ידי מחקרים משולבים של snRNA-seq ו- snATAC-seq מספק הבנה עמוקה יותר של מקור מחלת הלב המולדת26. מספר מעבדות מחקר חקרו את ההשפעות של שימור בהקפאה של רקמת הלב על snRNA-seq27. ביצוע snRNA-seq ו- snATAC-seq באמצעות רקמות מיקרו-חתוכות טריות ממודלים עכבריים של מחלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי ERA-CVD-2019 ו- ANR-JCJC-2020 ל- SS. אנו מודים למתקן הגנומיקה והביואינפורמטיקה (GBiM) מהמעבדה לגנטיקה רפואית U 1251/מרסיי ולסוקרים האנונימיים על מתן הערות חשובות.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
