Kjerneisolering fra musens hjerteprogenitorceller for epigenom og genuttrykksprofilering ved enkeltcelleoppløsning

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver cellekjernepreparering. Etter mikrodisseksjon og enzymatisk dissosiasjon av hjertevev til enkeltceller ble stamcellene frosset, etterfulgt av isolering av rene levedyktige celler, som ble brukt til enkeltkjerne-RNA-sekvensering og enkeltkjerneanalysen for transposasetilgjengelig kromatin med høykapasitetssekvenseringsanalyser.

Abstract

Det utviklende hjertet er en kompleks struktur som inneholder forskjellige stamceller styrt av komplekse reguleringsmekanismer. Undersøkelsen av genuttrykket og kromatintilstanden til individuelle celler tillater identifisering av celletype og tilstand. Enkeltcellesekvenseringstilnærminger har avslørt en rekke viktige egenskaper ved hjerteprogenitorcelleheterogenitet. Imidlertid er disse metodene generelt begrenset til ferskt vev, noe som begrenser studier med ulike eksperimentelle forhold, da det ferske vevet må behandles samtidig i samme kjøring for å redusere den tekniske variabiliteten. Derfor er det nødvendig med enkle og fleksible prosedyrer for å produsere data fra metoder som enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (snATAC-seq) i dette området. Her presenterer vi en protokoll for raskt å isolere kjerner for påfølgende enkeltkjerner dual-omics (kombinert snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metoden tillater isolering av kjerner fra frosne prøver av hjerteprogenitorceller og kan kombineres med plattformer som bruker mikrofluidiske kamre.

Introduction

Blant fødselsskader, medfødte hjertefeil (CHDs) er den vanligste, forekommer i ca 1% av levende fødsler hvert år ^1,2. Genetiske mutasjoner er identifisert i bare et mindretall av tilfellene, noe som innebærer at andre årsaker, som abnormiteter i genregulering, er involvert i etiologien til CHD ^2,3. Hjerteutvikling er en kompleks prosess med forskjellige og samvirkende celletyper, noe som gjør identifisering av kausale ikke-kodende mutasjoner og deres effekter på genregulering utfordrende. Organogenese av hjertet begynner med cellulære progenitorer som gir opphav til forskjellige undertyper av hjerteceller, inkludert myokardiale, fibroblast-, epikardiale og endokardiale celler ^4,5. Encellegenomikk fremstår som en nøkkelmetode for å studere hjerteutvikling og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse og sykdom⁶. Utviklingen av multi-omics-metoder for samtidig måling av forskjellige parametere og utvidelse av beregningsrørledninger har gjort det lettere å oppdage celletyper og subtyper i det normale og^{syke hjertet}. Denne artikkelen beskriver en pålitelig enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for frosne hjerteprogenitorceller oppnådd fra museembryoer som er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombinert)^7,8,9.

ATAC-seq er en robust metode som gjør det mulig å identifisere regulatoriske åpne kromatinregioner og posisjonering av nukleosomer^10,11. Denne informasjonen brukes til å trekke konklusjoner om plasseringen, identiteten og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Aktiviteten til kromatinfaktorer, inkludert remodelers, samt transkripsjonsaktiviteten til RNA-polymerase, kan dermed analyseres siden metoden er svært følsom for måling av kvantitative endringer i kromatinstruktur ^1,2. Dermed gir ATAC-seq en robust og upartisk tilnærming til å avdekke mekanismene som styrer transkripsjonsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller har også blitt validert for å måle kromatintilgjengelighet i enkeltceller, noe som avslører variabilitet i kromatinarkitekturen i cellepopulasjoner^10,12,13.

Selv om det har vært bemerkelsesverdige fremskritt innen enkeltceller de siste årene, er hovedproblemet behandlingen av de ferske prøvene som trengs for å utføre disse forsøkene¹⁴. For å omgå denne vanskeligheten er det utført ulike tester med sikte på å gjennomføre analyser som snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevev eller celler^15,16.

Flere plattformer har blitt brukt til å analysere encellede genomikkdata¹⁷. De mye brukte plattformene for enkeltcellegenuttrykk og ATAC-profilering er plattformer for multippel mikrofluidisk dråpeinnkapsling¹⁷. Siden disse plattformene bruker mikrofluidiske kamre, kan rusk eller aggregater tette systemet, noe som resulterer i ikke-brukbare data. Dermed avhenger suksessen til enkeltcellestudier av nøyaktig isolering av individuelle celler / kjerner.

Protokollen som presenteres her bruker en lignende tilnærming til nyere studier ved bruk av snRNA-seq og snATAC-seq for å forstå medfødte hjertefeil 18,19,20,21,22,23. Denne prosedyren benytter enzymatisk dissosiasjon av ferskt mikrodissekert hjertevev etterfulgt av kryopreservering av musens hjerteprogenitorceller. Etter tining blir de levedyktige cellene renset og behandlet for kjernefysisk isolasjon. I dette arbeidet ble denne protokollen vellykket brukt til å oppnå snRNA-seq og snATAC-seq data fra samme nukleære forberedelse av mus hjerte stamceller.

Protocol

Dyreprosedyren som ble vedtatt i denne studien ble godkjent av dyreetiske komiteer ved Aix-Marseille University (C2EA-14) og ble utført i henhold til protokoller godkjent av den utnevnte nasjonale etiske komiteen for dyreforsøk (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisasjon Apafis N°33927-2021111715507212). 1. Sette opp den tidsbestemte parringen før disseksjon For å generere museembryoer, utfør en tidsbestem…

Representative Results

Sammenlignet med fremstillingen av enkeltcellesuspensjoner for enkeltcelletilnærminger, er fremstillingen av enkeltkjernesuspensjoner mye mer utfordrende og krever en høyere grad av oppløsning og behandling. Nøkkelfaktoren for vellykket kombinert snRNA-seq og snATAC-seq er en ren og intakt kjernesuspensjon. Protokollen for effektiv kjerneisolering må tilpasses hver vevstype og tilstand (fersk eller frossen). Her er en optimalisert protokoll beskrevet for isolering av kjerner fra frosne musembryonale hjerteceller. Al…

Discussion

Analysen av den cellulære sammensetningen av det utviklende hjertet ved kombinerte snRNA-seq- og snATAC-seq-studier gir en dypere forståelse av opprinnelsen til medfødt hjertesykdom²⁶. Flere forskningslaboratorier har studert effekten av hjertevevskryopreservering på snRNA-seq²⁷. Gjennomføring av snRNA-seq og snATAC-seq ved hjelp av ferskt mikrodissekert vev fra musemodeller av menneskelig sykdom kan være logistisk utfordrende når man sammenligner forskjellige eksper…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% – EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number