Et sett med screeningteknikker for en rask oversikt over nøytrofilfunksjonen

Summary

Denne protokollen inneholder et sett med nøytrofile funksjonsanalyser som skal brukes som en screeningsmetode for å dekke funksjoner fra forskjellige signalveier. Protokollen inkluderer en innledende og enkel evaluering av cellelevedyktighet, renhet, reaktiv oksygenartsproduksjon, sanntidsmigrasjon, fagocytose og et foreløpig forslag om nøytrofile ekstracellulære feller.

Abstract

Neutrofiler er kjent som en av de første forsvarslinjene i den medfødte immunresponsen og kan utføre mange spesielle cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon, fagocytose, degranulering av cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigjøring av DNA som nøytrofile ekstracellulære feller (NET). Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet. Siden ferske nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige og svært variable blant individer, er det viktig å få mest mulig ut av de innsamlede prøvene. Forskere må ofte utføre screeninganalyser for å vurdere en oversikt over de mange nøytrofile funksjonene som kan påvirkes av spesifikke forhold som vurderes. Et sett med tester etter en enkelt isolasjonsprosess av nøytrofiler med normal tetthet ble utviklet for å imøtekomme dette behovet, og søkte en balanse mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet. Resultatene kan brukes til å resonnere og veilede grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren kan utføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av gjær på glassglass, og etterlater nok celler til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Videre inkluderer prosedyren en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET etter rask panoptisk farging observert ved lysmikroskopi, med mangel på spesifikke markører, om enn nok til å indikere om ytterligere innsats på den måten ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner kombinerer vanlige punkter blant testene, noe som reduserer analysetiden og utgiftene. Prosedyren ble kalt NeutroFun Screen, og selv om den har begrensninger, balanserer den de nevnte faktorene. Videre er målet med dette arbeidet ikke et bestemt testsett, men snarere en retningslinje som enkelt kan justeres til hvert laboratoriums ressurser og krav.

Introduction

Neutrofiler er de mest tallrike medfødte immuncellene i humant blod og er kjent for å spille en viktig rolle i infeksjon og betennelse, og er de første respondentene som kommer til stedet^{for vevskader}. I de senere år har det vært en økende anerkjennelse av den avgjørende rollen som nøytrofiler spiller i en rekke sykdommer og i å støtte homeostase². Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet ^3,4,5. Derfor er undersøkelse av nøytrofiler og deres mange uvanlige cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon⁶, fagocytose⁷, respiratorisk utbrudd⁸ og frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NET)⁷, avgjørende i mange forskningssammenhenger der det er nødvendig å vurdere potensielle nøytrofile funksjonelle, morfologiske, eller molekylære endringer utløst av spesifikke forhold som analyseres.

Ferskt isolerte nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige, svært dynamiske og lett aktiverte⁹. Imidlertid er en effektiv lagringsmetode som ikke påvirker nøytrofilresponsene ennå ikke oppnådd, noe som gjør det utfordrende å utføre flere analyser som må være uavbrutt. Videre kan tidligere beskrevne funksjonelle analyser^10,11, basert på analyser som krever cytometri og/eller fluorescerende farging, ikke være et levedyktig valg når en bred og innledende evaluering av nøytrofilen er nødvendig.

For å løse disse problemene beskriver denne protokollen et sett med tester som kan utføres etter en enkelt isolasjonsprosess, inkludert evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan brukes til å resonnere grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren, kalt NeutroFun Screen, ble designet for å omfatte de ledende effektoraktivitetene, unntatt degranulering, og kan fullføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer, inkludert 1 time aktivering. I tillegg kan de gjenværende cellene brukes til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Fordelen med denne metoden ligger i balansen mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet.

Videre er det en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET, uten spesifikke markører, men nok til å indikere om ytterligere innsats i den retningen ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner tar sikte på å kombinere felles poeng blant tester, redusere analysetiden og utgiftene. Hovedmålet med denne metoden er å gi en balansert, funksjonell analyse med hensyn til hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet som gir en oversikt over nøytrofilens respons, noe som gjør det til et nyttig første skritt i å undersøke effekten av nye stimuli på nøytrofiler med normal tetthet.

Protocol

Alle eksperimenter fulgte strengt de etiske retningslinjene fastsatt av det institusjonelle gjennomgangsstyret ved Universitetet i Brasilia (prosess 13364819.0.0000.5558), og prøver ble identifisert med koder for å sikre donoranonymitet. Cellene ble hentet fra normale friske mannlige donorer i alderen 18-35 år, som signerte det informerte samtykket og oppfylte følgende valgbarhetskriterier: ikke-røykere / dampere, ingen kroniske helsemessige forhold og ingen historie med inflammatoriske tilstander de siste 14 dagene…

Representative Results

Den tetthetsbaserte isolasjonsmetoden som ble brukt i denne studien (figur 1) oppfylte kriteriene for de foreslåtte forsøkene. Nøytrofile parametere oppnådd fra denne metoden inkluderte levedyktighet ≥98%, renhet ≥94% og celleutbytte ≥1,5 x 107, uten aktivering detekterbar ved screeningtestene. To relevante trinn i isolering av PMN er antikoagulasjon og fjerning av RBC. Å holde det antikoagulerte blodrøret eller sprøyten ved en mild gynging før lagdeling over tetthet…

Discussion

Nøytrofiler er svært dynamiske og responsive celler som er kortvarige og ennå ikke kan kryopreserveres¹⁹, noe som gjør undersøkelser av deres biologi utfordrende. Derfor er det viktig å følge nøye skritt for å oppnå levedyktige, berikede og hvilende nøytrofiler^11,20. Denne studien benyttet en tetthetsbasert isolasjonsteknikk som legger vekt på mild og minimal manipulasjon, samt bruk av lave temperaturer frem til aktiveringstrin…

Materials

CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma – Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma – Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma – Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma – Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma – Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma – Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma – Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma – Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software