Summary
Здесь мы представляем подробный визуальный протокол выполнения модели перевязки левого предсердия (LAL) у эмбриона птицы. Модель LAL изменяет внутрисердечный поток, который изменяет напряженную нагрузку при сдвиге стенки, имитируя синдром гипоплазии левых отделов сердца. Представлен подход к преодолению трудностей, связанных с этой сложной моделью микрохирургии.
Abstract
Благодаря своей четырехкамерной конфигурации зрелого желудочка, простоте культивирования, доступу к визуализации и эффективности, птичий эмбрион является предпочтительной моделью позвоночных животных для изучения сердечно-сосудистого развития. В исследованиях, направленных на понимание нормального развития и прогноза врожденных пороков сердца, широко используется эта модель. Микроскопические хирургические методы используются для изменения нормальной механической нагрузки в определенный момент времени эмбриона и отслеживания нисходящего молекулярно-генетического каскада. Наиболее распространенными механическими вмешательствами являются перевязка левой вителлиновой вены, конотранкальное бандажирование и перевязка левого предсердия (LAL), модулирующая внутрисосудистое давление и напряжение сдвига стенки из-за кровотока. LAL, особенно если она выполняется в яйцеклетке, является наиболее сложным вмешательством, с очень малым выходом образцов из-за чрезвычайно тонких последовательных микрохирургических операций. Несмотря на высокий риск, in ovo LAL очень ценен с научной точки зрения, поскольку имитирует патогенез синдрома гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО). СГЛОС является клинически значимым сложным врожденным пороком сердца, наблюдаемым у новорожденных. Подробный протокол для in ovo LAL описан в этой статье. Вкратце, оплодотворенные эмбрионы птиц инкубировали при температуре 37,5 °C и постоянной влажности 60%, как правило, до тех пор, пока они не достигали стадий Гамбурга-Гамильтона (HH) со 20 по 21. Скорлупа яиц была вскрыта, а внешняя и внутренняя оболочки удалены. Эмбрион осторожно поворачивали, чтобы обнажить луковицу левого предсердия общего предсердия. Предварительно собранные микроузлы из нейлоновых нитей 10-0 аккуратно располагались и завязывались вокруг почки левого предсердия. Наконец, эмбрион был возвращен в исходное положение, и LAL была завершена. Нормальный желудочек и желудочки с LAL-инструментами продемонстрировали статистически значимые различия в уплотнении тканей. Эффективная генерация моделей LAL будет способствовать исследованиям, посвященным синхронизированным механическим и генетическим манипуляциям во время эмбрионального развития сердечно-сосудистых компонентов. Кроме того, эта модель обеспечит возмущенный клеточный источник для исследований тканевых культур и сосудистой биологии.
Introduction
Врожденные пороки сердца (ВПС) – это структурные нарушения, возникающие из-за аномального эмбрионального развития1. Помимо генетических условий, на патогенез влияет измененная механическая нагрузка 2,3. Синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС), врожденный порок сердца, приводит к недоразвитию желудочка/аорты при рождении4 с высоким уровнем смертности 5,6. Несмотря на недавние успехи в клиническом лечении, динамика роста и развития сосудов при СГЛОС до сих пор неясна7. При нормальном эмбриональном развитии эндокард и миокард левого желудочка (ЛЖ) происходят от предшественников сердца по мере прогрессирования раннего эмбрионального формирования трубки сердца. Сообщается о постепенном наличии трабекуляции миокарда, утолщения слоев и пролиферации кардиомиоцитов2. При СГЛОС наблюдается измененное трабекулярное ремоделирование и уплощение левого желудочка, что в дальнейшем способствует гипоплазии миокарда из-за аномальной миграции кардиомиоцитов 2,8,9,10
Среди широко используемых модельных организмов для изучения развития сердца и понимания гемодинамических условий 11 предпочтение отдается эмбриону птицы из-за его четырехкамерного зрелого сердца и простоты культивирования11,12,13,14. С другой стороны, расширенный доступ к визуализации эмбрионов рыбок данио и трансгенных/нокаутных мышей обеспечивает явные преимущества11,12. На эмбрионе птицы были опробованы различные механические вмешательства, которые изменяют внутримурное давление и напряжение сдвига стенки в развивающихся сердечно-сосудистых компонентах. Эти модели включают лигирование левого вителлина, конотрункальное бандажирование15 и лигирование левого предсердия (LAL)11,12,16. Полученный фенотип, обусловленный измененной механической нагрузкой, можно наблюдать примерно через 24-48 ч после хирургического вмешательства в исследованиях, ориентированных на ранний прогноз11,13. Вмешательство LAL является популярным методом сужения функционального объема левого предсердия (LA) путем наложения шовной петли вокруг атриовентрикулярного отверстия. Кроме того, были выполнены микрохирургические вмешательства, нацеленные на перевязку правого предсердия (RAL)17,18. Точно так же некоторые исследователи нацеливаются на придаток левого предсердия (LAA) с помощью микроклипсов, чтобы уменьшить объем LA19,20. В некоторых исследованиях на атриовентрикулярный узел накладывают хирургическую капроновую нить19,21. Одним из используемых вмешательств является LAL, который может имитировать HLHS, но также является самой сложной моделью для выполнения, с очень малым выходом образцов из-за чрезвычайно тонких микрохирургических операций. В нашей лаборатории LAL проводится in ovo между 20-й и 21-й стадиями по шкале Гамбурга-Гамильтона (HH), до того, как общее предсердие будет полностью септировано 6,14,22,23. Вокруг ЛП накладывается хирургический шов, который изменяет внутрисердечный кровоток. В моделях СГЛОС ЛАЛ наблюдается повышенная жесткость стенок желудочков, измененные углы миоволокон и уменьшение размеров полости ЛЖ14,24.
В этой видеостатье представлен подробный протокол и подход к проведению in ovo LAL. Вкратце, оплодотворенные птичьи эмбрионы были инкубированы для микрохирургии, скорлупа яйца была вскрыта, а внешняя и внутренняя оболочки очищены. Затем эмбрион медленно вращали так, чтобы ЛП была доступна. Нейлоновый хирургический шов 10-0 был наложен на зачаток предсердий, и эмбрион был возвращен в его первоначальную ориентацию, завершив процедуру LAL25. LAL и нормальные желудочки сравнивают на уплотнение тканей и объем желудочков с помощью оптической когерентной томографии и базовой гистологии.
Успешно реализованная модель LAL, описанная здесь, будет способствовать фундаментальным исследованиям, посвященным эмбриональному развитию сердечно-сосудистых компонентов. Эта модель также может быть использована вместе с генетическими манипуляциями и передовыми методами визуализации. Кроме того, острая модель LAL является стабильным источником пораженных сосудистых клеток для экспериментов с тканевыми культурами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Оплодотворенные белые яйца леггорнов получают от проверенных поставщиков и инкубируют в соответствии с утвержденными университетом рекомендациями. Эмбрионы цыплят на стадиях с 18 (3-й день) по 24-й (4-й день) (стадии, представленные в этой статье) не считаются живыми позвоночными животными в соответствии с директивой Европейского союза (ЕС) 2010/63/EU и рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в США. Эмбрионы цыплят считаются «живыми животными» после 19-го дня инкубации в соответствии с законами США, но не для ЕС. Каждое яйцо маркируется датой начала вылупления и планируется к вылуплению не позднее10-го дня инкубации. После того, как из яиц вылупятся птенцы, их извлекают из инкубатора. Протокол выполняется на двух стендовых рабочих станциях (Станция 1 и Станция 2), ориентированных на специализированные этапы генерации моделей.
1. Подготовка перед микрохирургией
- Оплодотворенные яйцеклетки можно получить либо в центре разработки вакцин со специальным классом защиты от патогенов (SPF), либо через проверенную коммерческую ферму поставщика с помощью хрупкого курьера-курьера в контейнерах из сухого полистирола. Перед инкубацией аккуратно очистите яичную скорлупу безворсовыми салфетками, смоченными в 70% этаноле, чтобы удалить загрязнения.
- Критерии включения/исключения эмбрионов
- Не инкубируйте яйца, которые треснули или повредили во время транспортировки.
- Если во время процедуры LAL или после повторной инкубации отмечается кровотечение, не используйте эмбрион.
- Не следует использовать эмбрионы, развивающиеся в положении левой стороной вверх, так как гемодинамический кровоток может отличаться от нормальной ориентации.
- Эмбрионы Dıscard, развивающиеся с врожденными дефектами как до, так и после операции.
- Включите эмбрионы, которые достигают целевой стадии, развиваясь в своем первоначальном месте, имитируя HLHS в качестве модели LAL.
- Инкубируют оплодотворенные куриные яйца породы Ливорн (Gallus gallus domesticus L.), тупой конец, до желаемой стадии, обычно при HH20-2115 (37,5 °C, влажность 60%, 3,5 дня) (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать в яйцах постоянную температуру и влажность, чтобы увеличить урожайность. В зависимости от модели инкубатора, добавление поддона, наполненного дистиллированной водой, позволит поддерживать стабильную влажность. Авторами разработаны и рекомендованы чертежи дополнительной/вспомогательной системы контроля температуры и влажности, подходящей для большинства инкубаторов. Сведения об электронике, аппаратном обеспечении и коде этого датчика/блока управления собственной разработки представлены в репозиторииданных 26. Непрерывное мягкое встряхивание (вращение) яиц во время инкубации может обеспечить оптимальное положение эмбриона и, таким образом, привести к более высокому проценту «работоспособных» эмбрионов. Встряхивание также может работать с инкубаторами с такой производительностью и еще больше повысить производительность. - Перед началом процедуры подготовьте необходимое количество узлов, завязав свободный верхний узел в шов длиной 1,5 см 10-0. Убедитесь, что узел не туго затянут и достаточно велик, чтобы легко поместиться над предсердиями во время операции (Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Завяжите узлы заранее и храните их в стерильном растворе для цыплят перед использованием. Операция завязывания узлов требует использования двух рук для синхронного управления пинцетом. Поскольку это критический этап в протоколе, для отработки этого шага из шпаклевки можно сделать модель предсердия (рисунок 3). Это позволит улучшить навыки трехмерной микрохирургии, необходимые для выполнения шага 3.2.3 на станции 2 (рис. 4).
2. Работа на станции 1 (рис. 4А)
- Откройте окно с тупого конца яйца и удалите как наружную, так и внутреннюю оболочки15 (фиг. 5A-D).
- Откройте яичную скорлупу, осторожно треснув обратным концом пинцета, при этом свободные пальцы крепко поддерживают яйцо, чтобы уменьшить нежелательное распространение трещины.
- Так как LAL является длительной процедурой, сохраняйте температуру и влажность эмбриона, так как частота сердечных сокращений зависит от температуры. Таким образом, убедитесь, что начальное окно оболочки создано как можно меньше, ровно настолько, чтобы выполнять операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время работы не используются системы контроля влажности или температуры, но эти системы, если они доступны, улучшат урожайность. Если это возможно, система кондиционирования воздуха в лаборатории отключается, и процедура проводится при максимально возможной комнатной температуре (RT). Также рекомендуется оптимизация частоты сердечных сокращений эмбриона, которую можно контролировать с помощью температуры, во время операции. В некоторых лабораториях частота сердечных сокращений поддерживается на уровне чуть ниже 120 ударов в минуту с помощью контроля температуры во время работы LAL. Таким образом, контроль влажности вокруг операционной зоны еще больше увеличит производительность. Окна яичной скорлупы создаются как можно меньше, достаточно большими, чтобы обеспечить хирургический доступ. Это также относится к толстой внешней оболочке, которая, как правило, меньше яичной скорлупы только в пределах окружности эмбриона. Они обеспечивают поддержание температуры и влажности эмбриона. Открывая окно с тупого конца яйца, мелкие фрагменты скорлупы очищаются таким образом, чтобы эти кусочки не повредили вителлиновую сосудистую целостность и не привели к появлению нежелательных артефактов. Кроме того, в других лабораториях для изготовления окон используются изогнутые микрозубчатые ножницы. Кроме того, две ширины скотча можно использовать для стабилизации яичной скорлупы, чтобы предотвратить растрескивание. - С помощью микроножниц удалите только необходимую вителлиновую мембрану (Дополнительное видео 1).
- Нормальное эмбриональное развитие происходит правой стороной вверх. Как только эмбрион освободится от вителлиновой мембраны, поместите пинцет с закрытыми кончиками под дорсальный сегмент эмбриона и осторожно переверните эмбрион, чтобы обнажить левую сторону (т.е. левую сторону вверх) (рис. 6A, B; Дополнительное видео 2).
- Убедитесь, что почка левого предсердия теперь открыта, но все еще покрыта сложной мембранной системой, обычно состоящей из двойного слоя перикарда.
- Удалите мембраны, в том числе тонкие, непосредственно вокруг почки предсердия. Это еще один важный этап; Выполняйте удаление мембран из грубых оболочек и переходите к тонким мембранам вокруг почки левого предсердия. Приберегите самый тонкий пинцет для удаления тонкой мембраны (Дополнительное видео 3).
- Во время процесса удаления плодной оболочки сориентируйте эмбрион в положение левой стороной вверх, чтобы операция по установке узла на шаге 3.2 могла быть выполнена без дальнейшего перемещения. Для этого поднимите эмбрион с помощью мембран на шаге 2.6 и подвесьте его к яичной скорлупе, убедившись, что левая сторона обращена вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эмбрионы могут располагаться близко к периферии яичной скорлупы, и их может быть трудно оперировать. Тем не менее, эти эмбрионы, скорее всего, будут ориентированы правой стороной вверх и демонстрировать нормальное поведение, и могут быть включены в исследование. В этих случаях, при необходимости, затененное предсердие можно сделать более доступным, осторожно очистив мембрану перикарда тонким пинцетом #4 и удалив скорлупу яйца в обратном направлении (по направлению к отверстию скорлупы). Эти эмбрионы также могут быть подняты с помощью частей внеэмбриональных оболочек и зафиксированы в нужном положении, прикрепив один конец мембраны (конец пинцета) к яичной скорлупе, используя ее естественную липкость. Кроме того, пространство между головой и спинным мозгом эмбриона может быть расширено с помощью пинцета, чтобы открыть закрытое предсердие.
3. Операции на станции 2 (рис. 4Б)
- Под стереомикроскопом расположите предварительно подготовленный узел, начиная с шага 1.4, близко к эмбриону в доступном месте (рис. 6B). Теперь почка предсердия готова к завязыванию (дополнительное видео 4).
- Извлеките заранее подготовленный открытый узел и сориентируйте его на зачаток левого предсердия. Чтобы LAL работал, поместите яйцо в трехмерную ориентацию с уникальным наклоном.
- Правильно сориентируйте узел, чтобы выполнить процесс затяжки, не повредив эмбрионы.
- Оптимально очистите тонкие мембраны на шаге 2.7, чтобы уменьшить эффект бьющегося сердца.
- Затяните шов (Рисунок 6C). Для этого шага очень пригодится практика работы со шпаклевкой. Для фиктивных эмбрионов затяните узел ровно настолько, чтобы удержать узел.
- Затем с помощью микроножниц обрежьте лишние концы шва как можно ближе к бутону (Дополнительное видео 5).
- Будьте очень осторожны, чтобы только что отрезанные концы завязанного шва не были в состоянии проколоть близлежащие сосуды во время вращения или из-за сердцебиения.
- С помощью пинцета удалите лишние кусочки шва, отрезанные на шаге 3.3.
- Наконец, с помощью закрытого пинцета верните эмбрион в исходное положение, как в шаге 2.5 (Дополнительное видео 6).
- После завершения процесса LAL накройте яйцо двойным слоем парапленки и снова инкубируйте. Плотное и стерильное закрытие яиц имеет первостепенное значение для выживания, особенно после 24 часов инкубации. Если вы также хотите получить визуальный доступ, используйте парафин со стеклянными предметными стеклами.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении раннего эмбрионального периода яйца обычно инкубируются в течение 24-48 часов, пока они не достигнут примерно HH25 или HH27. Тем не менее, предела нет, и более поздние стадии могут быть изучены, как это пытались сделать другие исследователи. Для обеспечения высокой скорости работы рекомендуется использовать команду не менее двух человек. Один человек должен быть обучен и отвечать за вскрытие яйцеклетки, первоначальную очистку оболочки, ротацию и очистку оболочки вокруг почки левого предсердия. Другой человек несет ответственность только за первоначальную подготовку узла, его установку и затяжку. Окончательная ротация эмбриона может быть выполнена Человеком 1. Хирургическая операция на одном эмбрионе занимает около 4-5 минут. - До/после хирургических операций очищайте поверхности стола и инструменты этанолом. Обязательно нанесите свежий раствор для звона цыплят (NaCl, KCl, CaCl2 и NaHCO3)16,27 на металлические инструменты, соприкасающиеся с тканями эмбриона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для наблюдения за структурными и морфологическими изменениями, вызванными вмешательством LAL10, могут быть использованы передовые методы визуализации с временным разрешением. Кроме того, образцы LAL также поддаются молекулярным и биологическим методам19,28. В таблице 1 приведены примеры исследований, в которых использовались результаты модели LAL. В этом контексте вмешательство LAL было выполнено на эмбрионах цыплят, достигших HH20-21. Как контрольное (здоровое), так и LAL сердца были удалены из эмбриона в HH25-26. Затем образцы фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФА) при 4 °С 6,15. Затем извлеченные образцы сердца обезвоживали в растворах этанола с возрастающими концентрациями (70%, 96% и 100%) в течение 1 ч каждый. Наконец, образцы выдерживали в ксилоле при РТ в течение 0,5 ч, а перед секционированием проводили погружение парафина при толщине 10 мкм. Образцы, перенесенные на предметное стекло, окрашивали морилкой Elastica van Gieson. Срезы исследовали под стереомикроскопом, где измеряли поперечный диаметр желудочка. Мы также выполнили трехмерный неинвазивный метод оптической когерентной томографии (ОКТ) на некоторых образцах 11,29. Как контрольное, так и LAL сердца на HH25-26 были иссечены, а их диаметры в поперечном просвете измерены при ОКТ.
Результаты показали, что для LAL достигается более компактная структура миокарда со значительными морфологическими изменениями по сравнению с нормальным развитием (рис. 7). Кроме того, вокруг сердечного интерстиция наблюдается отложение компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, напоминающий фиброз миокарда, похожий на HLHS30. Чтобы лучше понять утолщение миокарда и трабекулярное уплотнение, были проведены морфометрические измерения пористости как в контрольных, так и в LAL-образцах. Как и ожидалось, вмешательство LAL привело к уменьшению полости левого желудочка и уплотнению трабекуляра за счет сужения межтрабекулярных углублений. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что LAL изменяет здоровую архитектуру желудочков и переориентирует трабекулярный аспект22. Аналогичным образом, модель LAL на HH29 привела к увеличению полости правого желудочка, изменению трабекулярной архитектуры и объема миокарда24.
Для подтверждения результатов, полученных в этом исследовании, была использована ОКТ-визуализация для измерения площади поперечного просвета желудочка и аксиальной длины (рис. 8). ЛАЛ показала достоверное уменьшение размера и диаметра левого желудочка по сравнению с контролем. Несмотря на то, что здесь сосредоточены только желудочки, также сообщается о влиянии LAL на развитие дуги аорты31. В недавнем исследовании, в котором мы принимали участие, сообщалось в 3D, что напряжение миокарда в средней стенке было увеличено в обоих желудочках после LAL на HH2532. Кроме того, в группах LAL наблюдалось увеличение толщины стенок по сравнению с контрольными группами на HH25. Это исследование согласуется с предыдущим исследованием Tobita et al.25, которое продемонстрировало значительное увеличение пиковых систолических эпикардиальных окружных деформаций в LAL LV при HH27.
Рисунок 1: Инкубационная система для эмбрионального роста. Оплодотворенные яйца белой курицы породы Леггорн (Gallus gallus) инкубировали в инкубаторе при постоянной влажности (60%) и температуре (37,5 °C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка узла LAL. Множественные узлы диаметром ~0,5-1 мм и длиной 1-2 см были изготовлены с использованием нейлоновых хирургических нитей 10-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Реплика эмбрионального левого предсердия, сделанная из шпаклевки. Копия отдела левого предсердия создается для тренировки и отработки шагов ориентации и смыкания узлов с помощью двух пинцетов. Это позволило нам провести множество проб и усовершенствовать эти шаги, прежде чем применить этот навык в реальном эмбрионе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подготовка станции . (A,B) Все материалы и растворы для микрохирургии были размещены в чистой зоне для Станции 1 и Станции 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Открытие окна с тупого конца яйцеклетки и удаление как внешней, так и внутренней оболочек. (А,Б) Небольшое окно было открыто с помощью микрохирургических инструментов на яичной скорлупе и включало весь эмбрион в HH20-21. (C) Фрагменты яичной скорлупы были удалены на первой стадии раскалывания. (Д,Э) Внезародышевые оболочки также были препарированы под микроскопом. (F) После того, как процесс LAL был завершен, яйцо было покрыто двойным слоем парапленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Снимок операции по перевязке левого предсердия in ovo (LAL). (A) Дорсальный вид эмбриона цыпленка в его нормальной ориентации. Эмбриональный желудочек, достигающий HH20-21, имеет примитивное общее предсердие (a), желудочек (v) и выходной тракт (ot). (B) Показан крупный план дорсального зародыша, перевернутого левой стороной вверх и расположения узла. (C) LA с шовным узлом. Сокращения: LA = левое предсердие; AA = дуга аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Удаление и обследование контрольного и LAL сердца. Как (А) контрольное, так и (Б) LAL сердца, достигшие стадии HH25-26, были удалены из эмбриона и исследованы под стереомикроскопом. Гистограмма показывает различия в поперечном диаметре сердца между группой LAL и контрольной группой, а также среднее ± стандартное отклонение (SD), по крайней мере, четырех репликаций. Масштабная линейка = 100 мкМ. Гистологическое исследование тканей сердца в образцах (C) контроля и (D) LAL с использованием метода окрашивания Elastica van Gieson. Гистограмма показывает различия в пористости (%), чтобы показать компрессию миокарда между LAL и контрольной группой, а также среднее ± SD, по крайней мере, двух репликаций. **p < 0,01. Для статистического анализа использовался GraphPad Prism версии 9.5.1. Масштабная линейка = 50 мкМ. Сокращения: LAL = перевязка левого предсердия; LA = левое предсердие; RA = правое предсердие; ПЖ = правый желудочек; ЛЖ = левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Оптическая когерентная томография. Как (А) контрольное, так и (В) LAL сердца, достигающее HH25-26, исследовали с помощью ОКТ. (C,D) Размер и длина просвета желудочков указаны на панелях (C) и (D) соответственно. Гистограммы представляют собой среднее значение ± SD не менее трех повторов. *p < 0,05; **p < 0,01; Для статистического анализа использовался GraphPad Prism версии 9.5.1. Масштабная линейка = 100 мкМ. Сокращения: LAL = перевязка левого предсердия; ПЖ = правый желудочек; ЛЖ = левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Обзор исследований, в которых использовалась модель перевязки левого предсердия (LAL) у эмбрионов птиц 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
Почти во всех газетах Лос-Анджелес имеет одинаковое значение на HH21. Влияние ЛАЛ исследуется на более поздних стадиях ГГ (стадия оценки). Сокращения: AVC = атриовентрикулярная подушка; LAV = левый атриовентрикулярный канал; РАВ = правый атриовентрикулярный канал; RA = правое предсердие; LA = левое предсердие; ПЖ = правый желудочек; ЛЖ = левый желудочек; SEN = субэндокард; IVS = межжелудочковая перегородка; микро-КТ = микрокомпьютерная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Типичная эффективность модели перевязки левого предсердия (LAL), созданной в HH21 и инкубированной до HH25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Дополнительное видео 1: Удаляются как внешняя, так и внутренняя оболочки птичьего эмбриона. Затем удаляется только вителлиновая мембрана, как показано с помощью микроножниц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 2: Пинцет помещают под дорсальный сегмент эмбриона правой стороной вверх и осторожно переворачивают, чтобы обнажить его зачаток левого предсердия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 3: Мембраны вокруг почки левого предсердия постепенно очищаются. Предсердие немного расширяется, что делает возможным размещение и завязывание узлов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 4: Шов длиной примерно 0,1-0,3 мм накладывается рядом с эмбрионом и затягивается вокруг него с помощью двух пинцетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 5: Лишние шовные концы узла аккуратно обрезаются микроножницами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 6: Эмбрион мягко возвращают в нормальную ориентацию. LAL завершен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При СГЛОС кровоток изменяется из-за структурных дефектов, что приводит к аномальной морфологии с левой стороны 4,6. Данная модель представляет собой практическую экспериментальную систему, позволяющую лучше понять прогрессирование СГЛОС и даже имитировать его патогенез8. Тем не менее, создание полностью клинически эквивалентной модели HLHS на животных является сложной задачей. В дополнение к представленной здесь птичьей модели LAL, в недавних исследованиях на мышах, плодах овец и лягушек была предпринята попытка воспроизвести морфологические, гемодинамические и патофизиологические особенности прогноза HLHS. У эмбрионов мышей механическая нагрузка изменяется с помощью эмболизирующего агента, вводимого в ЛК посредством вмешательства плода на 14,5-й день эмбриона (ЭД) (приблизительно HH40-41 у эмбрионов цыплят)34. В общей сложности 48% плодов, которые были положительно эмболизированы, дожили до беременности с небольшими ЛВ и ретроградным аортальным кровотоком. Длительный период гестации, дополнительные трудности при вмешательствах на ранних сроках и сложная хирургия плода могут ограничить осуществимость этой модели. Гипоплазию ЛЖ также имитировали на моделях плода ягненка путем заполнения ЛК силиконовой резиной через баллонный катетер35. В этой модели крупного животного объем ЛЖ достаточно уменьшен, но время выживания невелико, что приводит к низкому проникновению болезни. Альтернативный подход к вмешательству заключается в окклюзии овального отверстия с помощью чрескожной чреспеченочной катетеризации, как это было сделано у эмбрионального ягненка36, даже несмотря на то, что направление окклюзионного стента в овальное отверстие является очень сложной задачей. Модели овец в целом очень сложны из-за их уже существующей сосудистой морфологии и неблагоприятной физиологии легких. Таким образом, необходимость сезонного разведения, более поздний гестационный возраст и небольшой размер выборки еще больше ограничивают эту модель. Наконец, эмбрион Xenopus также представлен в качестве еще одной удобной модели для имитациисердечных заболеваний человека, несмотря на его трехкамерное сердце с одним желудочком и различия в структуре клеток нервного гребня. Доступность полногеномных микроинъекций и микрохирургических вмешательств, а также длительное время выживаемости также делают эту модель привлекательной.
В предыдущих исследованиях проникновение болезни в 6 из 39 оперированных птичьих эмбрионов было представлено как 15% в модели LAL34. Тем не менее, среднее проникновение HLHS модели эмбриона цыпленка, которое мы исследовали на ранней стадии (достигнув HH25 и HH27), составило 66% (12 из 18 оперированных эмбрионов птиц). Профессор Седмера сообщил, что среднее время выживания эмбрионов может составлять HH40 (ED14)19. Другие группы, регулярно выполняющие эту лигирование, сообщали о высоких показателях успеха в ранние моменты времени (например, 75% до HH29, 50% до HH34 и 20% до HH38)30. Однако на более поздних стадиях появляется отчетливый фенотип, и смертность увеличивается. Несмотря на то, что проникновение болезни в куриные эмбрионы может быть относительно низким, цель этой модели состоит в том, чтобы лучше изучить этиологию и патологию пренатального СГЛО, особенно на ранних стадиях.
Из-за очень маленького размера эмбриона цыпленка на ранней стадии, пред- и послеоперационное вмешательство LAL может привести к ряду осложнений. В качестве средства для предотвращения загрязнения яичную скорлупу и скамейки очищают 70% этиловым спиртом, а на протяжении всей процедуры можно использовать перчатки. Критическим этапом в протоколе LAL является удаление всей мембраны перикарда, чтобы обеспечить хорошее прилегание узла вокруг почки левого предсердия. Кроме того, мы обнаружили, что команда из двух человек чрезвычайно полезна, особенно в обучении и специализации на определенном наборе навыков, необходимых на этапах протокола. Такой подход ускоряет процедуру и кривую ее обучения. Таким образом, риск кровотечения и загрязнения является второстепенным и перевешивает преимущества предлагаемой системы напарников. Рекомендуется использовать заранее подготовленный шовный материал, хранящийся в стерильном растворе для цыплят. Кроме того, поддержание низкой прочности затягивания шва также имеет решающее значение для более высокого выхода эмбриона. Более плотные узлы на зародышке предсердий, применяемые при HH21, могут привести к преждевременной недостаточности ЛЖ, которая не в состоянии разработать клинически критическое участие дефектов проводимости, коронарного и вторичного ремоделирования миоархитектона, которые были хорошо описаны в предыдущих исследованиях22. В частности, использование тончайших и неиспользованных пинцетов и ножниц на определенных этапах и относительно тупых на других может уменьшить случайное кровотечение. Наконец, сразу после завершения узла зародыш следует быстро повернуть в исходное положение, а окно яичной скорлупы закрыть двойным слоем парапленки, чтобы сохранить его температуру и влажность. Типичный выход для модели LAL, достигающий HH25, представлен в таблице 2. В дополнение к уменьшению размера желудочков также могут развиваться клапанные пороки развития, такие как атрезия митра/аорты. Тяжесть этих поражений увеличивает заболеваемость на более поздних стадиях, как при СГЛО. Из-за проблем, обсуждаемых здесь, по сравнению с другими механическими вмешательствами, выполняемыми с эмбрионами цыплят, такими как конотрункальное кольцевание, модель LAL приводит к гораздо более низким уровням выхода. Мы считаем, что благодаря представленным здесь мерам предосторожности можно достичь 50% доходности.
Птичий эмбрион является идеальной моделью позвоночных животных для исследования сердечно-сосудистого развития благодаря своей морфологической структуре, размеру, низкой стоимости, простоте культивирования и манипуляций38,39. Эта модель также обеспечивает естественную защиту от болезнетворных микроорганизмов40. Инструментальные эмбрионы могут быть использованы в расширенной визуализации in vivo и локальных манипуляциях с миРНК. Таким образом, консервативные участки генов человека и курицы доступны с помощью секвенирования дробовика Сэнгера и физического картирования39, что приводит к углубленным механочувствительным исследованиям19. Кроме того, микроматричный подход, примененный Krejčí et al., был использован для измерения успеха в отношении потенциальной обратимости гемодинамических изменений в структуре миокарда. Таким образом, идентификация генов, дифференциально экспрессируемых между левым и правым желудочками, может быть использована в качестве критерия идеального периода вмешательства, когда начинаются необратимые изменения33.
В заключение следует отметить, что потенциальные будущие направления микрохирургического применения в модели эмбриона цыпленка включают использование методов редактирования генов сердечно-сосудистой системы с акцентом на специфические матриксные гены и молекулярные сигнальные пути, что способствует развитию тканево-клеточных культур и технологий визуализации32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность компании Tubitak 2247A за предоставление финансирования. Авторы также выражают благодарность PakTavuk Gıda. A. S., Стамбул, Турция, за обеспечение оплодотворенных яйцеклеток и поддержку сердечно-сосудистых исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
