感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立
Summary
このプロトコルは、神経(免疫)学研究のために、胚17日目のマウス脳から中枢神経系細胞培養を生成するユニークな方法を提示します。このモデルは、RT-qPCR、顕微鏡、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまな実験手法を使用して分析できます。
Abstract
中枢神経系(CNS)のモデルは、 in vivoで 見られる相互接続された細胞の複雑なネットワークを再現する必要があります。CNSは、主にニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアで構成されています。動物の使用を置き換え、削減するための努力が高まっているため、CNS感染症および病状の治療法の開発を可能にする、生来の細胞特性を探索するために、さまざまな in vitro 細胞培養システムが開発されています。特定の研究課題は、(誘導された)多能性幹細胞などのヒトベースの細胞培養システムによって対処できますが、ヒト細胞を扱う作業には、可用性、コスト、および倫理に関して独自の制限があります。ここでは、マウスの胚性脳から細胞を単離および培養するための独自のプロトコルについて説明します。得られた混合神経細胞培養物は、 in vivoで脳に見られるいくつかの細胞集団および相互作用を模倣する。現在の同等の方法と比較して、このプロトコルは脳の特性をより厳密に模倣し、より多くの細胞を獲得するため、1匹の妊娠中のマウスからより多くの実験条件を調査できます。さらに、プロトコルは比較的簡単で再現性が高いです。これらの培養物は、96ウェルベースのハイスループットスクリーン、24ウェル顕微鏡分析、フローサイトメトリーおよび逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)分析用の6ウェル培養など、さまざまなスケールでの使用に最適化されています。この培養法は、 in vitro 法の利便性を備えたCNSの複雑さの文脈の中で感染と免疫を調査するための強力なツールです。
Introduction
中枢神経系(CNS)の理解を深めることは、多くの神経炎症性疾患および神経変性疾患の治療選択肢を改善するために重要です。CNSは、脳、脊髄、および視神経内の相互接続された細胞の複雑なネットワークであり、ニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、およびそれらの自然免疫細胞であるミクログリア1で構成されています。in vitroアプローチは、多くの場合、有意義な研究を行うために必要なマウスの数を大幅に減らすことができます。しかし、CNSの複雑な性質により、細胞株を使用してin vivoの状況を再現することは不可能です。混合神経細胞培養は、置換、還元、改良(3R)の原則に沿って、関連するモデルで神経(免疫)学の質問を調査するための非常に貴重な研究ツールを提供します2,3。
Thomsonらは、前述の全ての主要なCNS細胞型に分化する出生前脊髄細胞を用いた細胞培養方法を記載した4。このシステムはまた、シナプス形成、有髄軸索、およびランヴィエの結節を有する。この培養方法の主な制限は、脊髄であるため、脳を有用にモデル化せず、胚13日目(E13)の脊髄からの細胞収量が収縮していることです。したがって、これにより、調査できる実験条件の数が制限されます。そこで本研究では、動物に対する必要量を減らすために、細胞収量を増加させた脳の特性を再現する新しい細胞培養システムの開発を目指しました。
Thomsonらを出発点として、純粋に出生前のマウスの脳に由来する細胞培養モデルを開発しました。これらの培養物は、脊髄培養物と同じ細胞集団、相互接続性、および治療オプションを持っていますが、比較すると髄鞘形成が少ない点が異なります。しかし、約3倍高い細胞収量を有するCNS インビトロ モデルを有することは、より効率的であり、より少ないマウスおよびより少ない時間で胚を処理する。この独自の培養システムは、顕微鏡分析用のガラスカバースリップや、ハイスループット研究用の96ウェルプレートを含むさまざまなサイズのプラスチックウェルプレートを使用するなど、複数のダウンストリームアプリケーションとスケール向けに最適化しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
CNSは、脳から脊髄にまたがる複雑なネットワークであり、主にニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリアなど、多くの細胞型で構成されています1。各細胞は、CNS 9,10,11の恒常性を維持し、課題に対する適切な応答を生成する上で重要な役割を果たすため、これらすべての細胞タイプを含む培養…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エドガーとリニントンの研究室のメンバー、特にクリス・リニントン教授、ダイアナ・アルセニ博士、カティア・ミュックリッシュ博士のアドバイス、有益なコメント、そして私たちがこれらの文化を立ち上げる際の文化への供給の支援に感謝します。特に、Cell Profiler パイプラインの出発点を提供してくださった Muecklisch 博士に感謝します。この作業は、MSソサエティ(助成金122)とユーリとローナチェルナヨフスキー財団によってMPに支援されました。グラスゴー大学がJCとMPに資金を提供する。ウェルカムトラスト(217093 / Z / 19 / Z)および医学研究評議会(MRV0109721)をGJGに譲渡します。
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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